HCV核心蛋白作用下的巨噬細(xì)胞變化及在肝細(xì)胞增殖中的相互作用.pdf

1、目的:
　　 越來(lái)越多研究表明，嗜肝性丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)是導(dǎo)致慢性化肝炎、乃至原發(fā)性肝癌的主要病原體，HCV不僅可以感染肝細(xì)胞，在很多免疫細(xì)胞（如B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞）內(nèi)也可檢測(cè)到HCV的復(fù)制，且HCV的病毒蛋白可與寄宿細(xì)胞內(nèi)、外的相應(yīng)蛋白或受體結(jié)合，影響該細(xì)胞的生物學(xué)活性:如非結(jié)構(gòu)蛋白NS3可通過(guò)封閉TLR3途徑抑制固有免疫應(yīng)答或通過(guò)活化TLR2受體途徑促進(jìn)固有免疫應(yīng)答發(fā)生;胞膜蛋白

2、E2與NK細(xì)胞表面受體CD81結(jié)合抑制NK細(xì)胞功能等。提示在HCV感染宿主過(guò)程中，與宿主免疫細(xì)胞可能通過(guò)多種途徑相互作用，而HCV、免疫細(xì)胞、肝細(xì)胞三者的相互影響，既有可能促使HCV的清除，也有可能有利于HCV的免疫逃逸，導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生。
　　 HCV核心蛋白(HCVcore)作為HCV的重要結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒核衣殼的組成部分，除參與病毒的組裝，還會(huì)影響著宿主細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)代謝以及凋亡等一系

3、列生化過(guò)程:如轉(zhuǎn)染HCVcore的HepG2可通過(guò)自分泌TGF-α，引起細(xì)胞內(nèi)MAPK/ERK通路活化，最終導(dǎo)致HepG2的增殖加快;HCVcore還可抑制抑癌基因p53啟動(dòng)子的活性，參與HCC的發(fā)生。庫(kù)否氏細(xì)胞是定居于肝臟內(nèi)的一類重要的巨噬細(xì)胞，約占肝臟細(xì)胞總數(shù)的15％～20％，發(fā)揮重要的免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)作用。然而在HCV持續(xù)感染時(shí)，表達(dá)HCVcore蛋白的受體C1qR的單核細(xì)胞可被募集到肝臟組織，在肝臟炎性微環(huán)境中分化為不同亞型的

4、巨噬細(xì)胞，包括經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞M1、替代途徑激活的巨噬細(xì)胞M2、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、髓系來(lái)源的抑制細(xì)胞等，這些不同亞型巨噬細(xì)胞可分泌不同的細(xì)胞因子，在病毒的感染與腫瘤的形成及擴(kuò)散中發(fā)揮不同的作用。換言之，在HCV的慢性感染過(guò)程中，HCVcore蛋白與巨噬細(xì)胞表面受體C1qR結(jié)合導(dǎo)致巨噬細(xì)胞發(fā)生了哪些生物學(xué)變化，這些變化與HCV所致的疾病的進(jìn)程有哪些關(guān)系，以及在肝臟微環(huán)境中肝細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間是如何互相制約，互相協(xié)調(diào)都不十分清楚。

5、　　 本研究旨在了解在HCVcore蛋白作用下的巨噬細(xì)胞與不同的人肝細(xì)胞株相互作用后，肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)生的變化，以期探討巨噬細(xì)胞在HCV導(dǎo)致的HCC中所充當(dāng)?shù)慕巧?，為HCV的慢性化機(jī)制的研究和免疫治療提供新的視角。因此，采用了以下實(shí)驗(yàn)策略:1、應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得HCVcore蛋白，作用巨噬細(xì)胞后，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清及巨噬細(xì)胞與不同人肝細(xì)胞株(L02、HepG2)相互作用，研究HCVcore蛋白作用后的巨噬細(xì)胞與肝細(xì)胞增殖的關(guān)系;

6、2、在了解HCV作用下的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清可以促肝細(xì)胞增殖的前提下，用Transwell小室培養(yǎng)系統(tǒng)（非直接接觸）共培養(yǎng)HCVcore蛋白、巨噬細(xì)胞及人肝細(xì)胞株（L02、HepG2），通過(guò)肝細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達(dá)的變化，深入研究相關(guān)機(jī)制;3、根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)RT-PCR、ELISA、Westernblot、流式細(xì)胞術(shù)等手段了解巨噬細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子、炎性細(xì)胞因子以及細(xì)胞膜分子的變化以深入揭示HCVcore蛋白以及肝細(xì)胞代謝對(duì)巨噬細(xì)胞的作

7、用。
　　 方法:
　　 1、PCR方法從JFH-1株(HCV2a)全長(zhǎng)基因質(zhì)粒上擴(kuò)增HCVcore基因，克隆至pMD18-T載體并測(cè)序，后經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，將其克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a/HCVcore，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)獲得高效表達(dá)目的蛋白的包涵體，經(jīng)純化和復(fù)性、LPS定量檢測(cè)后，行SDS-PAGE和Westernblot鑒定。
　　 2、PMA誘導(dǎo)人單核細(xì)

8、胞株Thp1分化為巨噬細(xì)胞PMA-Thp1，以RT-PCR檢測(cè)HCVcore蛋白作用后細(xì)胞表面受體C1qRmRNA表達(dá)水平，驗(yàn)證原核表達(dá)蛋白HCVcore的生物學(xué)活性，同時(shí)設(shè)PBS、LPS作用PMA-Thp1作為對(duì)照;使用不同濃度HCVcore蛋白作用PMA-Thp1，確定HCVcore蛋白作用最適濃度。
　　 3、HCVcore蛋白作用PMA-Thp1后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，以不同濃度（10％細(xì)胞培養(yǎng)上清+90％完全培養(yǎng)基、20％

9、細(xì)胞培養(yǎng)上清+80％完全培養(yǎng)基、40％細(xì)胞培養(yǎng)上清+60％完全培養(yǎng)基）分別與人肝細(xì)胞株L02、HepG2共培養(yǎng)，CCK8法檢測(cè)培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)肝細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)設(shè)PBS作用的PMA-Thp1細(xì)胞培養(yǎng)上清或僅含有HCVcore蛋白的完全培養(yǎng)基作用的肝細(xì)胞組作為陰性對(duì)照和蛋白對(duì)照。
　　 4、HCVcore蛋白作用PMA-Thp124h后收集PMA-Thp1細(xì)胞，經(jīng)絲裂霉素處理后分別與人肝細(xì)胞株L02

10、、HepG2共培養(yǎng)（肝細(xì)胞與PMA-Thp1細(xì)胞數(shù)比值分別為25∶1、50∶1），CCK8法檢測(cè)培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)肝細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)以PBS作用的PMA-Thp1細(xì)胞或僅含完全培養(yǎng)作用的肝細(xì)胞組作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。
　　 5、用Transwell小室培養(yǎng)系統(tǒng)將HCVcore蛋白作用的PMA-Thp1細(xì)胞分別與人肝細(xì)胞株L02、HepG2（非直接接觸）共培養(yǎng)24h，行Westernblot檢測(cè)肝細(xì)

11、胞內(nèi)MAPK通路相關(guān)蛋白(ERK、JNK、p38)的活性，同時(shí)設(shè)PBS作用PMA-Thp1共培養(yǎng)的肝細(xì)胞組、HCVcore單獨(dú)作用的肝細(xì)胞組及肝細(xì)胞組作為對(duì)照。
　　 6、HCVcore蛋白作用PMA-Thp1后，RT-PCR檢測(cè)PMA-Thp1細(xì)胞促炎和抗炎因子（IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-8、TGF-β）mRNA水平變化;ELISA檢測(cè)PMA-Thp1細(xì)胞培養(yǎng)上清抗炎因子TGF-β的表達(dá)變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PM

12、A-Thp1細(xì)胞膜表面與M1、M2巨噬細(xì)胞表型有關(guān)分子(CD14、CD16、CD206、CD86)表達(dá)變化，同時(shí)設(shè)PBS、LPS、LPS+HCVcore作用的PMA-Thp1組作為對(duì)照;Westernblot檢測(cè)HCVcore蛋白、肝細(xì)胞共同作用的PMA-Thp1細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB、STAT3、STAT1)的活性。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功構(gòu)建了pET28a/HCVcore原核表達(dá)質(zhì)粒，并得以表達(dá)。經(jīng)鱟試劑檢

13、測(cè)表達(dá)蛋白中LPS含量為0.9EU/ml。SDS-PAGE電泳和Westernblot結(jié)果顯示，純化后獲得分子量約為21KD的單一條帶，可與鼠抗人HCVcore單克隆抗體特異性雜交。
　　 2、經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子(CD11b、CD11c)，結(jié)果顯示，以40ng/ml佛波酯(PMA)作用Thp148h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，巨噬細(xì)胞特異的細(xì)胞表面分子CD11b、CD11cmRNA水平顯著升高(P＜0.05)

14、。
　　 3、Real-timePCR結(jié)果顯示:HCVcore蛋白作用PMA-Thp16h、12h后其受體C1qRmRNA水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);并確定HCVcore作用PMA-Thp1最適濃度為10μg/ml。
　　 4、細(xì)胞增殖曲線顯示HCVcore蛋白作用PMA-Thp1收集細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)L02細(xì)胞增殖的影響:與陰性對(duì)照組相比，不同濃度細(xì)胞培養(yǎng)上清均使L02細(xì)胞增殖加快;與陰性對(duì)照和蛋白對(duì)照組相比，20

15、％細(xì)胞培養(yǎng)上清使L02增殖顯著(P＜0.05)。
　　 5、細(xì)胞增殖曲線顯示HCVcore蛋白作用PMA-Thp1收集細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響:10％細(xì)胞培養(yǎng)上清作用的HepG2在24h、48h、72h時(shí)間點(diǎn)生長(zhǎng)均大于陰性對(duì)照和蛋白對(duì)照組，其中48h、72h時(shí)間點(diǎn)差別顯著(P＜0.05)，20％上清組和40％上清組對(duì)HepG2增殖作用不明顯。
　　 6、HCVcore蛋白作用PMA-Thp1后收集的細(xì)胞經(jīng)絲

16、裂霉素固定后與肝細(xì)胞共培養(yǎng)，與對(duì)照組相比，無(wú)明顯促肝細(xì)胞增殖作用，說(shuō)明巨噬細(xì)胞膜分子對(duì)肝細(xì)胞增殖作用無(wú)影響。
　　 7、Westernblot顯示HCVcore蛋白作用PMA-Thp1與人肝細(xì)胞株共培養(yǎng)后，與對(duì)照組比較，L02細(xì)胞內(nèi)磷酸化的ERK表達(dá)明顯升高，但磷酸化的JNK和p38表達(dá)沒(méi)有改變;而HepG2細(xì)胞內(nèi)只有磷酸化的JNK表達(dá)明顯升高。
　　 8、HCVcore蛋白作用PMA-Thp1不同時(shí)間后，(1)RT-P

17、CR結(jié)果顯示:細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-8、TGF-βmRNA水平與PBS對(duì)照組比較均有明顯改變(P＜0.05);(2)ELISA結(jié)果顯示:細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，含量為168pg/ml;(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:細(xì)胞膜表面分子CD14、CD16、CD206的表達(dá)與其他三組均無(wú)區(qū)別，CD86表達(dá)與PBS作用組相同;(4)Westernblot結(jié)果顯示:與PBS對(duì)照組相比，

18、磷酸化的NF-κB65和NF-κB105表達(dá)在1h和4h升高，磷酸化的STAT1和STATR3表達(dá)無(wú)明顯動(dòng)態(tài)改變。
　　 9、HCVcore蛋白、肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞三者相互作用致與巨噬細(xì)胞分化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活化:(1)與core蛋白、L02細(xì)胞共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞磷酸化的STAT3的表達(dá)明顯增加，而與core蛋白、HepG2共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的磷酸化STAT3的表達(dá)則無(wú)明顯改變;(2)與L02細(xì)胞、巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的對(duì)照組相比，L

19、02、巨噬細(xì)胞、core蛋白三者共培養(yǎng)致磷酸化的STAT3表達(dá)升高的同時(shí)，磷酸化的STAT1表達(dá)為降低狀態(tài)。
　　 結(jié)論:
　　 1、成功構(gòu)建、表達(dá)了具有生物學(xué)活性的HCVcore蛋白。
　　 2、HCVcore蛋白作用PMA-Thp1巨噬細(xì)胞后的細(xì)胞上清有促進(jìn)肝細(xì)胞株L02、HepG2增殖的作用，可能與巨噬細(xì)胞分泌的可溶性因子有關(guān)，而與巨噬細(xì)胞表面分子以及HCVcore蛋白直接作用無(wú)關(guān)。
　　 3、HC

20、Vcore蛋白作用PMA-Thp1后促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，在L02細(xì)胞可能與上調(diào)磷酸化的ERK表達(dá)相關(guān)，反之，L02細(xì)胞、core蛋白、巨噬細(xì)胞三者共培養(yǎng)可上調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)磷酸化STAT3的含量。而對(duì)HepG2細(xì)胞的影響僅表現(xiàn)為磷酸化的JNK含量上調(diào)，HepG2對(duì)巨噬細(xì)胞的影響作用不明顯。
　　 4、HCVcore蛋白作用PMA-Thp1可致細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生動(dòng)態(tài)改變，但與不同肝細(xì)胞相互作用后的結(jié)果不完全相同，提示與不同特