牛β-乳球蛋白在人腸道腫瘤細(xì)胞中相互作用蛋白的研究.pdf

1、β-乳球蛋白(β-1actoglobulin，β-LG)是乳清蛋白的主要成分，屬于Lipocalin家族，能和視黃醇、β-胡蘿卜素、維生素D等脂溶性小分子化合物結(jié)合，起到載體作用，因此，具有應(yīng)用于口服結(jié)腸定位給藥系統(tǒng)的潛力。由于β-LG具有保護脂溶性小分子不受胃腸道環(huán)境影響的作用，研究β-LG進入腸道細(xì)胞的方式具有重要意義。目前關(guān)于β-LG受體的報道還比較少，只有關(guān)于人惡性多發(fā)性畸胎瘤細(xì)胞、紅細(xì)胞、生殖細(xì)胞、哺乳動物雜交瘤細(xì)胞中受體的研

2、究，有關(guān)β-乳球蛋白在腸道細(xì)胞中受體的研究還未見報道。本課題通過免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)技術(shù)結(jié)合一維聚丙烯酰胺凝膠電泳以及納升級液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(nanoLC-MS/MS)技術(shù)研究牛β-LG在腸道腫瘤細(xì)胞中的識別受體。
　　選擇體外腸道腫瘤研究較為常用的細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞和LoVo細(xì)胞進行體外培養(yǎng)，作為本課題的受試細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞形態(tài)伸展連接成片，傳代后72 h時細(xì)胞匯

3、合度達到90％以上。LoVo細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，48 h時匯合度達到90％。將受試細(xì)胞以106個/mL的濃度接種于玻底培養(yǎng)皿。使用熒光探針分別標(biāo)記細(xì)胞膜、細(xì)胞核;激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標(biāo)記的β-LG與細(xì)胞作用0 min、15 min、30 min、60 min時β-乳球蛋白與細(xì)胞的相互作用情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在β-LG分別與Caco-2細(xì)胞和LoVo細(xì)胞相互孵育的0～30 min內(nèi)，β-LG隨時間的延長逐漸在細(xì)胞膜外側(cè)聚集，但在30～60 min

4、內(nèi)β-LG在細(xì)胞膜外側(cè)的聚集量沒有明顯變化。
　　進一步研究β-LG與腸道腫瘤細(xì)胞的相互作用，將β-LG與Caco-2細(xì)胞和LoVo細(xì)胞分別進行1h孵育后，使用Co-IP分離β-LG及其在腸道腫瘤細(xì)胞上的相互作用蛋白。將Co-IP分離下來的樣品進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE)電泳、考馬斯亮藍(lán)染色

5、、免疫印跡法檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Co-IP分離出的樣品經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離后、考馬斯亮藍(lán)染色觀察發(fā)現(xiàn)，在20～70 kDa之間存在蛋白條帶，但無法觀察到β-LG的蛋白條帶;經(jīng)免疫印跡法檢測，發(fā)現(xiàn)Co-IP分離出的樣品存在β-LG，說明Co-IP成功分離β-LG及其腸道腫瘤細(xì)胞相互作用蛋白。
　　利用硝酸銀染色法和nanoLC-MS/MS技術(shù)鑒定β-LG在腸道腫瘤細(xì)胞Caco-2細(xì)胞和LoVo細(xì)胞的相互作用蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩株腸道腫