血管生成素相互作用蛋白質(zhì)的鑒定及其在細(xì)胞遷移中的作用.pdf

1、血管生成素（Angiogenin，ANG）具有促進(jìn)血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖的雙重活性，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其作用的分子機(jī)制未明。由于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在生命活動中扮演著重要角色，因此研究ANG相互作用蛋白質(zhì)是闡明ANG功能及分子機(jī)制的有效途徑。
　　 本論文的第一部分運(yùn)用免疫共沉淀與質(zhì)譜技術(shù)在HeLa細(xì)胞中篩選到20個可能與ANG相互作用的蛋白質(zhì)，其中包括了2個已知的ANG結(jié)合蛋白。通過對這20個蛋白質(zhì)的功能注釋和相互

2、作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)其中4個蛋白質(zhì)，即含IQ結(jié)構(gòu)域的GTP酶激活蛋白（IQ motif containing GTPase activating protein l，IQGAP1）、非肌型肌球蛋白重鏈（non-muscle myosin heavy chain9，MYH9）、α-輔肌動蛋白4（alpha-actinin4，ACTN4）及β-肌動蛋白（beta-actin，ACTB）與actin細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)及細(xì)胞粘附、遷移相關(guān)，并與Rac

3、l一起構(gòu)成了一個與actin細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路相關(guān)的ANG相互作用蛋白質(zhì)子網(wǎng)絡(luò)，提示ANG參與上述過程。隨后利用免疫共沉淀技術(shù)證實，這4個蛋白質(zhì)與ANG在HeLa細(xì)胞內(nèi)的相互作用是真實的。
　　 由于actin骨架系統(tǒng)的運(yùn)動與細(xì)胞粘附是細(xì)胞遷移的重要組成步驟，因此我們推測ANG很可能通過調(diào)節(jié)上述兩個過程而調(diào)節(jié)了細(xì)胞的遷移。為了證實我們的猜想，第二部分首先利用免疫熒光技術(shù)檢測了ANG與actin骨架蛋白在細(xì)胞中的共定位情況。結(jié)果表明

4、，ANG與actin骨架蛋白結(jié)合于細(xì)胞-基質(zhì)粘附所形成的黏著斑區(qū)域。隨后，我們檢測了ANG對細(xì)胞骨架及黏著斑形態(tài)、活性的影響。抑制內(nèi)源ANG表達(dá)后，利用熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對F-actin進(jìn)行染色以顯示細(xì)胞骨架形態(tài)的變化；免疫熒光法標(biāo)記黏著斑蛋白paxillin，檢測黏著斑形態(tài)的變化；同時Westem-blot法檢測黏著斑激酶(FAK)磷酸化程度的改變。結(jié)果表明，ANG干擾后actin應(yīng)力纖維顯著增粗，黏著斑顯著增大，但是數(shù)量減少，EGF

5、促進(jìn)的黏著斑激酶的活化受阻。最后，劃線法實驗結(jié)果表明，干擾內(nèi)源ANG后EGF促進(jìn)的細(xì)胞遷移速度減慢。綜合以上結(jié)果，我們認(rèn)為ANG很可能通過與actin骨架蛋白相互作用來調(diào)節(jié)actin骨架系統(tǒng)的運(yùn)動與細(xì)胞粘附，最終影響細(xì)胞遷移能力。
　　 另一個得到驗證的ANG結(jié)合蛋白為損傷DNA結(jié)合蛋白2（damage-specificDNA binding protein2，DDB2），該蛋白在紫外誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮作用，提示ANG也

6、可能參與該過程。我們初步探索了紫外輻照刺激下ANG蛋白水平的變化及其對紫外誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。由于這部分結(jié)果較為初步，因此放在附呈現(xiàn)，進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行中。
　　 綜合研究結(jié)果，本論文創(chuàng)新地證明：1.ANG在HeLa細(xì)胞內(nèi)與20個蛋白質(zhì)有潛在的相互作用；2.ANG可在HeLa細(xì)胞內(nèi)與IQGAP1、MYH9、ACTN4、ACTB及DDB2等相互作用；3.ANG與actin骨架蛋白在黏著斑位置相互作用，從而影響actin骨架和黏