肝癌細胞中熱休克蛋白27相互作用蛋白質的分離和鑒定.pdf

1、目的： 肝癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，對化療和放療均不敏感，手術根治率僅占15％，容易早期轉移和術后復發(fā)、轉移。轉移又是腫瘤最重要的惡性表型之一，是一個多分子參與高度復雜有序的過程。有研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白在人類癌癥大范圍的過度表達，并且牽涉腫瘤細胞增殖、分化、侵襲和轉移、死亡，并被免疫系統(tǒng)識別。熱休克蛋白27（HSP27）作為小熱休克蛋白亞家族中的重要一員，近年來與腫瘤的關系日益受到重視，它通過對細胞的增殖、分化及細胞凋亡

2、的信號轉導調節(jié)參與了一些腫瘤的發(fā)生及侵襲轉移過程，具體機制仍不十分清楚，但越來越多的證據(jù)顯示細胞凋亡與腫瘤轉移存在相關性。本實驗通過對HSP27及其結合蛋白的研究，篩選出肝癌中HSP27的相互作用蛋白，為下一步探索基因治療腫瘤及其轉移提供實驗基礎和依據(jù)。 方法： 1.采用DMEM培養(yǎng)液（含10％小牛血清）培育肝癌HepG2.2215細胞。 2.M-PER蛋白裂解液收集HepG2.2215細胞總蛋白。 3.

3、采用免疫共沉淀技術從HepG2.2215細胞總蛋白得到相應的HSP27結合蛋白，直接酶解后進行液相色譜-電噴霧離子阱串聯(lián)質譜分析（LC-ESI-ITMS/MS），得到相應的肽序列標簽（peptide sequence tags，PST）。 4.用免疫共沉淀和蛋白質印跡分析技術對所鑒定的HSP27相互作用蛋白之一HSP90進行了驗證。 結果： 通過搜索數(shù)據(jù)庫在肝癌細胞系中首次鑒定了7個HSP27結合蛋白，分別是熱休

4、克蛋白90（HSP90）、熱休克蛋白70（HSP70）、特異性下調葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP-78）、賴氨酰羥化酶（lysyl hydroxylase）、細胞角蛋白9（Keratin，typeⅠ cytoskeletal9）、細胞角蛋白10（Keratin，typeⅠ cytoskeletal10）和細胞角蛋白1（Keratin，typeⅡ cytoskeletal1）。所鑒定的7個結合蛋白可以劃分為三個作用范疇，分別是：分子伴侶、細胞