PRRSV nsp4相互作用細胞蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）又名“藍耳病”是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的首要傳染病之一。該病以皮膚耳朵發(fā)紺、妊娠母豬繁殖障礙、哺乳仔豬的高死亡率、各年齡段豬的呼吸障礙、持續(xù)性感染等為主要特征，其病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)。PRRSV基因組為單股正鏈RNA病毒，能夠編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白和14個非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp)。nsp4具有3C樣絲氨酸蛋白酶活

2、性，能夠切割前體多聚蛋白pp1a/pp1ab產(chǎn)生多個非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp3-12)。為了研究nsp4在PRRSV感染過程中的作用,本研究通過大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得純化nsp4蛋白，免疫新西蘭大白兔后制備了高效價的針對nsp4的兔多抗血清。另外，對nsp4的蛋白質(zhì)組學(xué)也進行了研究，構(gòu)建nsp4真核表達載體，轉(zhuǎn)染293T細胞獲得Pulldown產(chǎn)物，質(zhì)譜分析后利用W estern blot、免疫共沉淀、激光共聚焦驗證出nsp4與細胞蛋白Myos

3、in IIb（MYH10)、S RCAP、TRIM28相互作用。
　　主要的研究內(nèi)容如下：
　　1.PRRSV nsp4抗體制備與鑒定：將HP-PRRSV TA-12（GenBank登錄號：HQ416720） nsp4的基因克隆到表達載體pET28a（+）上，獲得重組表達質(zhì)粒pET28a-nsp4，重組質(zhì)粒在Trasseta(DE3)細胞中經(jīng)IPT G誘導(dǎo)獲得了高效表達,并獲得可溶性的重組蛋白。利用鎳離子親和柱(Ni-NTA

4、)純化獲得高純度的重組蛋白nsp4。用純化后的重組蛋白nsp4免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。ELISA檢測抗體效價可達106，Western-blot和IFA檢測結(jié)果表明所制備的多克隆抗體具有良好的特異性，能夠特異性地識別PRRSV感染宿主細胞后病毒自身產(chǎn)生的ns p4；
　　2.nsp4蛋白質(zhì)組學(xué)研究：將nsp4克隆入真核表達載體pEGFP-C1中，構(gòu)建nsp4真核表達載體，將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-nsp4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染29

5、3T細胞大量表達，利用G FP-Trap beads進行pulldown實驗沉淀出與nsp4相互作用的細胞蛋白。Western blot方法驗證pulldown實驗操作成功后，將pulldown產(chǎn)物送去質(zhì)譜分析，獲得45個與nsp4相互作用的細胞蛋白；
　　3.nsp4相互作用細胞蛋白的篩選與鑒定：從質(zhì)譜分析結(jié)果當中篩選出與nsp4相互作用可能性高的三種細胞蛋白MYH10，SRCAP、TRIM28。Wester n blot方法結(jié)

6、果表明Pulldown產(chǎn)物中確實存在MYH10、TRIM28；分別用MYH10，S RCAP、TRIM28抗體做免疫共沉淀結(jié)果表明CO-IP產(chǎn)物中都存在GFP-nsp4融合蛋白；激光共聚焦表明MYH10，SRCAP、TRIM28與nsp4均有不同程度的共定位現(xiàn)象，MYH10，SRCAP、TRIM28與HP-PRRSV也存在明顯的共定位。
　　綜上所述得出結(jié)論：
　　PRRSV nsp4與MYH10，SRCAP、TRIM28三