PRC17相互作用蛋白的篩選和初步鑒定.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩63頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、目的: PRC17是一個新近發(fā)現(xiàn)的癌基因,在多種腫瘤組織和細胞株中高表達。尋找和初步鑒定PRC17癌蛋白可能的相互作用蛋白,將有助于闡明PRC17的功能和其導致細胞惡性轉化的機制,為人類腫瘤的早期診斷和防治提供新線索。 方法: 為尋找PRC17癌蛋白可能的相互作用蛋白,以pGEX-6P-1為載體,構建了GST-PRC17融合蛋白原核表達質(zhì)粒PRC17/pGEX;將pGEX-6P-1和PRC17/pGEX質(zhì)粒分別轉

2、導入大腸桿菌BL21并經(jīng)IPTG大量誘導表達GST和GST-PRC17蛋白后,用Glutathione Sepharose 4B對GST和GST-PRC17蛋白分別進行了親和純化。 以純化的GST蛋白為對照,將GST-PRC17融合蛋白與HeLa細胞裂解物進行GSTPull-down分析;沉淀的蛋白進行SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色后,將PRC17可能的結合蛋白條帶進行肽指紋(PMF)圖和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)分析;將獲得的數(shù)

3、據(jù)輸入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行檢索,以獲得與數(shù)據(jù)匹配的蛋白信息,初步篩選出PRC17蛋白的可能相互作用蛋白。 為初步鑒定篩選出的β微管蛋白與PRC17之間的相互作用,以GST蛋白為對照,用GST-PRC17融合蛋白與HeLa細胞裂解物進行GSTpull-dwon分析;用抗β微管蛋白抗體進行Western Blot分析以檢測沉淀中的β微管蛋白。 為研究PRC17癌蛋白在細胞內(nèi)的分布,以pEGFP為載體,構建了EGFP-PRC17綠

4、色熒光蛋白真核表達質(zhì)粒PRC17/pEGFP;為研究β微管蛋白在細胞內(nèi)的分布,用RT-PCR方法,從制備的HeLa細胞總RNA中擴增了β微管蛋白2C的cDNA完整開放讀碼框架(openreading frame,ORF),將之插入pDsRed-Monomer載體后,得到DsRed-β微管蛋白2C(紅色熒光蛋白)真核表達質(zhì)粒TubB2C/pDsRed。將EGFP-PRC17/pEGFP和DsRed-TubB2C/pDsRed質(zhì)粒共轉染He

5、La細胞后,在熒光顯微鏡下觀察PRC17和β微管蛋白在細胞內(nèi)的定位。 結果: 構建的GST-PRC17融合蛋白原核表達質(zhì)粒PRC17/pGEX經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后出現(xiàn)1662 bp特征性片段,PRC17 cDNA序列經(jīng)測序證實無誤。大腸桿菌BL21在分別用PRC17/pGEX和pGEX-6P-1轉化后,由IPTG誘導表達的蛋白分子量均符合預期,為89.2 kDa(GST-PRC17融合蛋白)和28.4 kD

6、a(GST蛋白),而未轉入任何質(zhì)粒的BL21和轉入pGEX-6P-1或GST-PRC17/pGEX質(zhì)粒而未經(jīng)IPTG誘導的BL21陰性對照,則在相應分子量處僅見非常弱的非特異性蛋白條帶。Western Blot分析結果顯示抗GST抗體可特異性識別GST-PRC17蛋白,但不能識別陰性對照的非特異性蛋白。在非變性條件下(1%NP40裂解液和超聲破碎儀裂解細菌菌體),GST-PRC17和GST蛋白被用Glutathione Sepharos

7、e 4B進行了初步親和純化。用純化的GST和GST-PRC17蛋白與HeLa細胞裂解物進行GST Pull-down分析,發(fā)現(xiàn)多條PRC17的可能結合條帶,其中以大約23 kDa,55 kDa和100 kDa分子量處的三條蛋白條帶較明顯,而陰性對照GST蛋白和未與HeLa細胞裂解物進行結合反應的GST-PRC17蛋白的相應分子量處無明顯蛋白條帶或蛋白條帶非常弱。經(jīng)肽指紋圖(PMF)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)檢測和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索,兩條蛋白

8、條帶分別匹配β微管蛋白和TBC1D3蛋白(即PRC17自身),而另一蛋白條帶無高可信度的匹配結果。 為初步鑒定PRC17與β微管蛋白之間的相互作用,以GST蛋白為對照,用GST-PRC17融合蛋白與HeLa細胞裂解物進行GST pull-dwon實驗后,用抗β微管蛋白抗體進行Western Blot分析,顯示PRC17與β微管蛋白結合,而陰性對照GST蛋白并不結合β微管蛋白,證實PRC17蛋白可特異性結合β微管蛋白。 將

9、構建并鑒定的EGFP-PRC17(綠色熒光蛋白)和DsRed-β微管蛋白(紅色熒光蛋白)真核表達質(zhì)粒共轉染HeLa細胞后,在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)PRC17分布在細胞漿內(nèi)及細胞質(zhì)膜上,細胞內(nèi)的PRC17主要呈小泡樣結構廣泛分布;而β微管蛋白在細胞內(nèi)也呈廣泛分布。PRC17和β微管蛋白在細胞內(nèi)的分布有待用激光共聚焦掃描顯微鏡進行深入研究。 結論: 1.PRC17可能存在多種結合蛋白; 2.β微管蛋白可能是PRC17的結合

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論