PRC17相互作用蛋白的篩選和初步鑒定.pdf

1、目的： PRC17是一個新近發(fā)現(xiàn)的癌基因,在多種腫瘤組織和細胞株中高表達。尋找和初步鑒定PRC17癌蛋白可能的相互作用蛋白,將有助于闡明PRC17的功能和其導致細胞惡性轉化的機制,為人類腫瘤的早期診斷和防治提供新線索。 方法： 為尋找PRC17癌蛋白可能的相互作用蛋白,以pGEX-6P-1為載體,構建了GST-PRC17融合蛋白原核表達質(zhì)粒PRC17/pGEX;將pGEX-6P-1和PRC17/pGEX質(zhì)粒分別轉

2、導入大腸桿菌BL21并經(jīng)IPTG大量誘導表達GST和GST-PRC17蛋白后,用Glutathione Sepharose 4B對GST和GST-PRC17蛋白分別進行了親和純化。 以純化的GST蛋白為對照,將GST-PRC17融合蛋白與HeLa細胞裂解物進行GSTPull-down分析；沉淀的蛋白進行SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色后,將PRC17可能的結合蛋白條帶進行肽指紋(PMF)圖和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)分析；將獲得的數(shù)

3、據(jù)輸入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行檢索,以獲得與數(shù)據(jù)匹配的蛋白信息,初步篩選出PRC17蛋白的可能相互作用蛋白。 為初步鑒定篩選出的β微管蛋白與PRC17之間的相互作用,以GST蛋白為對照,用GST-PRC17融合蛋白與HeLa細胞裂解物進行GSTpull-dwon分析；用抗β微管蛋白抗體進行Western Blot分析以檢測沉淀中的β微管蛋白。 為研究PRC17癌蛋白在細胞內(nèi)的分布,以pEGFP為載體,構建了EGFP-PRC17綠

4、色熒光蛋白真核表達質(zhì)粒PRC17/pEGFP;為研究β微管蛋白在細胞內(nèi)的分布,用RT-PCR方法,從制備的HeLa細胞總RNA中擴增了β微管蛋白2C的cDNA完整開放讀碼框架(openreading frame,ORF),將之插入pDsRed-Monomer載體后,得到DsRed-β微管蛋白2C(紅色熒光蛋白)真核表達質(zhì)粒TubB2C/pDsRed。將EGFP-PRC17/pEGFP和DsRed-TubB2C/pDsRed質(zhì)粒共轉染He

5、La細胞后,在熒光顯微鏡下觀察PRC17和β微管蛋白在細胞內(nèi)的定位。 結果： 構建的GST-PRC17融合蛋白原核表達質(zhì)粒PRC17/pGEX經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后出現(xiàn)1662 bp特征性片段,PRC17 cDNA序列經(jīng)測序證實無誤。大腸桿菌BL21在分別用PRC17/pGEX和pGEX-6P-1轉化后,由IPTG誘導表達的蛋白分子量均符合預期,為89.2 kDa(GST-PRC17融合蛋白)和28.4 kD

6、a(GST蛋白),而未轉入任何質(zhì)粒的BL21和轉入pGEX-6P-1或GST-PRC17/pGEX質(zhì)粒而未經(jīng)IPTG誘導的BL21陰性對照,則在相應分子量處僅見非常弱的非特異性蛋白條帶。Western Blot分析結果顯示抗GST抗體可特異性識別GST-PRC17蛋白,但不能識別陰性對照的非特異性蛋白。在非變性條件下(1％NP40裂解液和超聲破碎儀裂解細菌菌體),GST-PRC17和GST蛋白被用Glutathione Sepharos

7、e 4B進行了初步親和純化。用純化的GST和GST-PRC17蛋白與HeLa細胞裂解物進行GST Pull-down分析,發(fā)現(xiàn)多條PRC17的可能結合條帶,其中以大約23 kDa,55 kDa和100 kDa分子量處的三條蛋白條帶較明顯,而陰性對照GST蛋白和未與HeLa細胞裂解物進行結合反應的GST-PRC17蛋白的相應分子量處無明顯蛋白條帶或蛋白條帶非常弱。經(jīng)肽指紋圖(PMF)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)檢測和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索,兩條蛋白

8、條帶分別匹配β微管蛋白和TBC1D3蛋白(即PRC17自身),而另一蛋白條帶無高可信度的匹配結果。 為初步鑒定PRC17與β微管蛋白之間的相互作用,以GST蛋白為對照,用GST-PRC17融合蛋白與HeLa細胞裂解物進行GST pull-dwon實驗后,用抗β微管蛋白抗體進行Western Blot分析,顯示PRC17與β微管蛋白結合,而陰性對照GST蛋白并不結合β微管蛋白,證實PRC17蛋白可特異性結合β微管蛋白。 將

9、構建并鑒定的EGFP-PRC17(綠色熒光蛋白)和DsRed-β微管蛋白(紅色熒光蛋白)真核表達質(zhì)粒共轉染HeLa細胞后,在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)PRC17分布在細胞漿內(nèi)及細胞質(zhì)膜上,細胞內(nèi)的PRC17主要呈小泡樣結構廣泛分布；而β微管蛋白在細胞內(nèi)也呈廣泛分布。PRC17和β微管蛋白在細胞內(nèi)的分布有待用激光共聚焦掃描顯微鏡進行深入研究。 結論： 1.PRC17可能存在多種結合蛋白； 2.β微管蛋白可能是PRC17的結合