癌蛋白TRE17與MLC2相互作用的初步鑒定.pdf

1、目的： 與動物比較,人類腫瘤的發(fā)生機制非常復雜。深入研究功能尚不清楚的腫瘤相關基因包括癌基因將有助于完全闡明人類腫瘤的發(fā)生機制。TRE17是一個功能尚不清楚的癌基因,其導致正常細胞惡性轉化的機制有待闡明。初步明確TRE17與肌球蛋白調節(jié)性輕鏈(myosinregulatory light chain,MLC2)之間的相互作用將有助于深入研究TRE17在細胞骨架重塑和腫瘤發(fā)生中的作用,為腫瘤的診斷、預防和治療提供初步線索。

2、 方法： 為研究TRE17癌蛋白與MLC2蛋白之間的相互作用,用RT-PCR方法,從制備的HeLa細胞總RNh中擴增了MLC2蛋白的cDNA完整開放讀碼框架(open reading frame,ORF),并插入pGEX-6P-1載體,構建了GST-MLC2融合蛋白原核表達質粒MLC2/pGEK;在將pGEX-6P-1和MLC2/pGEX質粒分別轉導入大腸桿菌BL21,并經(jīng)IPTG大量誘導表達GST和GST-MLC2蛋白后,在非

3、變性條件下(超聲破碎儀裂解細菌菌體)用Glutathione Sepharose 4B對GST和GST-MLC2蛋白分別進行了親和純化。用HA-TRE17(447)蛋白真核表達質粒HA-TRE17(447)/pcDNA3轉染培養(yǎng)的HeLa細胞,以GST蛋白為對照,將純化的GST-MLC2蛋白與該轉染細胞裂解物進行GST pull-down分析；沉淀的蛋白進行SOS-PAGE后,用抗HA抗體進行WesternBlot分析,以檢測沉淀中的H

4、A-TRE17(447)蛋白。 以pGEX-6P-1為載體,分別構建了GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco融合蛋白原核表達質粒GST-TRE17(447)/pGEX和GST-TRE17onco/pGEX;轉導入大腸桿菌BL21后,用IPTG大量誘導表達和在非變性條件下純化了GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco融合蛋白；在用PreScissionTM蛋白酶切除GST-MLC2蛋白中的GST標

5、志蛋白后,以GST蛋白為對照,將獲得的不含GST標志蛋白的MLC2蛋白分別與GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco融合蛋白進行GST pull-down分析；沉淀的蛋白進行SDS-PAGE后,用考馬斯亮藍染色觀察沉淀中的MLC2蛋白,以探討TRE17癌蛋白是否直接結合MLC2蛋白。 結果： 構建的GST-MLC2融合蛋白原核表達質粒MLC2/pGEx經(jīng)BamH和EcoR I雙酶切后出現(xiàn)525 bp特征性

6、片段,MLC2 cDNA序列經(jīng)測序證實無誤。大腸桿菌BL21在分別用MLC2/pGEX和pGEX-6P-1轉化后,由IPTG誘導表達的蛋白分子量均符合預期,為46.6 kDa(GST-MLC2融合蛋白)和28.4 kDa(GST蛋白),而未經(jīng)IPTG誘導的陰性對照,則未見相應部位出現(xiàn)蛋白條帶。誘導表達GST-MLC2和GST蛋白的細菌菌體被用超聲破碎儀裂解,并經(jīng)Glutathione Sepharose 4B親和純化后,GST-MLC2

7、和GST蛋白純度已達90％以上。以GST蛋白為對照,用GST-MLC2融合蛋白與經(jīng)HA-TRE17(447)蛋白真核表達質粒HA-TRE17(447)/pcDNA3轉染的HeLa細胞裂解物進行GST pull-down實驗后,用抗HA抗體進行Western Blot分析,顯示MLC2蛋白與TRE17(447)結合,而陰性對照GST蛋白并不結合TRE17(447),證實MLC2蛋白特異性結合TRE17(447)。 經(jīng)BamH I和

8、Xho I雙酶切后,GST-TRE17(447)/pGEX質粒出現(xiàn)1360 bp特征性片段,而GST-TRE17onco/pGEX質粒出現(xiàn)2415 bp特征性片段。TRE17(447)和TRE17onco cDNA序列經(jīng)測序證實無誤。大腸桿菌BL21分別用GST-TRE17(447)融合蛋白表達質粒GST-TRE17(447)/pGEX和GST-TRE17onco融合蛋白表達質粒GST-TRE17onco/pGEX轉化后,由IPTG誘導

9、表達的蛋白分子量均符合預期,大約為78.3 kDa(GST-TRE17(447)蛋白)和116.4 kDa(GST-TRE17onco蛋白)。而未用IPTG誘導的對照,則未見相應部位出現(xiàn)蛋白條帶。在非交性條件下,GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco蛋白被用Glutathione Sepharose4B進行了初步親和純化。以GST蛋白為對照,用純化的GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco蛋白分別與不含