肺炎鏈球菌熱休克蛋白DnaJ相互作用蛋白的篩選及鑒定.pdf

1、目的：肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumonia，S.pn）熱休克蛋白DnaJ是一個(gè)毒力因子，但其對(duì)肺炎鏈球菌致病機(jī)制的作用尚不清楚，本文擬通過尋找DnaJ在S.pn中的相互作用蛋白來揭示其對(duì)細(xì)菌毒力的影響。
　　 方法：主要采用兩種蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)——免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，co-IP)和細(xì)菌雙雜交來進(jìn)行相互作用蛋白的篩選與驗(yàn)證。質(zhì)粒pAE03含有標(biāo)簽蛋白——綠色熒光蛋白(

2、Green Fluorescent Protein，GFP)，將DnaJ整合到該質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒pAE03-dnaJ-gfp并轉(zhuǎn)化S.pn菌株D39。收集轉(zhuǎn)化細(xì)菌和野生型D39裂解液，用結(jié)合了GFP抗體的beads去捕獲帶GFP標(biāo)簽的DnaJ和它結(jié)合的相互作用蛋白，捕獲蛋白質(zhì)混合物采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，

3、SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)化細(xì)菌與D39的差異蛋白質(zhì)通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/IonizationTime of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）鑒定;然后用細(xì)菌雙雜交技術(shù)驗(yàn)證這種相互作用，并通過β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)和westernblot檢測(cè)熱休克時(shí)這種相互作用對(duì)候選蛋白的影響。同時(shí)，本文構(gòu)建了誘餌質(zhì)粒pBT-dna

4、J和肺炎鏈球菌基因組文庫(kù)，應(yīng)用細(xì)菌雙雜交技術(shù)篩選DnaJ相互作用的蛋白質(zhì)并用co-IP加以證實(shí)。根據(jù)候選蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果，用最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)實(shí)驗(yàn)研究該相互作用對(duì)細(xì)菌耐藥性的影響。
　　 結(jié)果：應(yīng)用co-IP技術(shù)篩選并經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定出9個(gè)可能與DnaJ有相互作用的蛋白，包括DnaK、Gap、Eno、SpxB等。細(xì)菌雙雜交技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了

5、DnaJ與其中3個(gè)蛋白——DnaK、Eno、SpxB間的相互作用。而p-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)和western blot證實(shí)，熱休克時(shí)DnaJ可以幫助Eno和SpxB正確折疊并保護(hù)它們不受降解，還可易化Eno的胞外分泌。同時(shí)，應(yīng)用細(xì)菌雙雜交技術(shù)篩選到了一個(gè)DnaJ相互作用的蛋白質(zhì)——SPD1264，并通過co-IP證實(shí)兩者間確實(shí)存在相互作用。通過文獻(xiàn)查閱及初步的MIC實(shí)驗(yàn)，表明該蛋白可能與細(xì)菌對(duì)青霉素、氨芐青霉素及卡那霉素的耐藥存在一定的聯(lián)系。