肺炎鏈球菌毒力蛋白基因工程疫苗的實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　 肺炎鏈球菌是社區(qū)獲得性感染最常見的致病菌,全球每年有超過100萬兒童死于肺炎鏈球菌感染性疾病。目前肺炎鏈球菌對抗生素多重耐藥情況日趨嚴重,使肺炎鏈球菌感染的治療面臨重大挑戰(zhàn),WHO提出應(yīng)用疫苗預(yù)防肺炎鏈球菌感染是減少耐藥菌傳播、緩解抗生素耐藥壓力,保護高危人群的唯一方法。
　　 國內(nèi)外越來越多的臨床研究發(fā)現(xiàn)目前應(yīng)用的肺炎鏈球菌23價莢膜多糖疫苗和7價蛋白-多糖結(jié)合疫苗存在血清型依賴,成本昂貴,不降低肺

2、炎鏈球菌鼻咽部攜帶等不足。研發(fā)新一代非血清型依賴的安全、便攜、廉價的新型肺炎鏈球菌疫苗具有巨大的經(jīng)濟效益和深遠的社會價值。
　　 肺炎鏈球菌作為條件致病菌,多種毒力因子獨立或協(xié)同的參與了其粘附、定植、遷移、侵襲性致病的全過程?；诜窝祖溓蚓嚓P(guān)毒力蛋白的DNA疫苗具有非血清型依賴、覆蓋率廣、造價低廉等優(yōu)勢,成為第三代肺炎鏈球菌疫苗的研究熱點。
　　 靶抗原的選擇,優(yōu)勢載體系統(tǒng)的應(yīng)用和理想的接種途徑是新型肺炎鏈球菌DNA疫

3、苗研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本課題組前期研究已經(jīng)證實了肺炎鏈球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)及肺炎鏈球菌黏附素A(pneumococcal surfaceadhesion A,PsaA)的聯(lián)合是最優(yōu)勢的候選抗原組合形式,但是傳統(tǒng)的DNA疫苗免疫途徑并不具備激發(fā)鼻咽部特異性sIgA抗體保護的能力,而且免疫原性較弱。鑒于鼻咽部定植是肺炎鏈球菌感染的首要步驟,研究如何優(yōu)化DNA疫苗的載體系統(tǒng),選擇

4、理想的免疫途徑進而增強肺炎鏈球菌DNA疫苗的免疫效能,尤其是增加其鼻咽部粘膜免疫保護效能具有重要意義。
　　 因此,本課題圍繞“肺炎鏈球菌基因工程疫苗的實驗研究”,進行了以下三部分研究工作:(1)第一部分:基于優(yōu)勢靶抗原組合(pspaA+psaA基因),構(gòu)建肺炎鏈球菌多價DNA疫苗。復(fù)制肺炎鏈球菌鼻咽部攜帶及腹腔攻擊動物模型,裸質(zhì)粒肌肉注射方式免疫接種,評價其免疫原性及保護效能;(2)第二部分:基于載體一宿主致死平衡原理,設(shè)計改

5、造現(xiàn)有減毒沙門菌為宿主菌的沙門菌-原核質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng),將其攜帶的原核質(zhì)粒改造為非抗性基因篩選的真核質(zhì)粒,構(gòu)建新型減毒沙門菌為載體的多價肺炎鏈球菌DNA基因工程疫苗,復(fù)制肺炎鏈球菌鼻咽部攜帶及腹腔攻擊動物模型,經(jīng)口服途徑免疫接種,評價其穩(wěn)定性、免疫原性及免疫保護效能;(3)第三部分:進一步利用基因組學(xué)及分子遺傳學(xué)技術(shù)針對優(yōu)勢靶抗原進行分子進化及比較基因組學(xué)的初步研究。旨在為肺炎鏈球菌新一代基因工程疫苗的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實驗室依據(jù)。

6、r>　　 方法:
　　 1.分子克隆技術(shù)構(gòu)建PsaA和PspA'(PspA的N端抗原表位所在區(qū)域基因片段)的重組真核表達質(zhì)粒PsaA-pcDNA3.1和PspA'-pcDNA3.1。兩種重組質(zhì)粒DNA疫苗PsaA-pcDNA3.1和PspA'-pcDNA3.1裸質(zhì)粒單獨或聯(lián)合肌肉注射免疫小鼠,ELISA檢測免疫小鼠脾細胞分泌細胞因子及血清中特異性抗體IgG水平;復(fù)制小鼠肺炎鏈球菌D39株鼻咽部攜帶和腹腔侵襲性感染模型,觀察免疫

7、小鼠鼻咽部肺炎鏈球菌攜帶改變和腹腔攻擊小鼠21天生存情況。
　　 2.新型減毒沙門菌為載體的多價肺炎鏈球菌DNA疫苗構(gòu)建及其穩(wěn)定性、免疫效能檢測。
　　 (1)肺炎鏈球菌DNA疫苗的新型減毒沙門菌載體系統(tǒng)構(gòu)建:基于pcDNA3.1(+),應(yīng)用.BspHI、Xmn I雙酶切獲得片段SV400ri-Neor-SV40Pa-pLICori和Pcmv-MCS-BGHpA-flori,再用SalⅠ酶切SV400ri-Neor-SV

8、40pA-pIJCori獲得片段pUCori;將酶切獲得的pUCori、Pcmv-MCS-BGHpA-flori兩個片段及變形鏈球菌asd基因PCR擴增產(chǎn)物進行連接,構(gòu)建新互補質(zhì)粒pcDNA3.1000,并最終轉(zhuǎn)化入宿主菌沙門菌x4550中(pcDNA3.1000x)。
　　 (2)分子克隆技術(shù)構(gòu)建新型減毒沙門菌為載體的肺炎鏈球菌DNA疫苗pcDNA3.1001x(編碼pspA'基因)和pcDNA3.1002x(編碼psaA基因

9、),并檢測重組質(zhì)粒在哺乳動物細胞BHK-21中的表達(RT-PCR及Western-blot)及質(zhì)粒穩(wěn)定性。新型減毒沙門菌為載體的肺炎鏈球菌DNA疫苗pcDNA3.1001x和pcDNA3.1002x單獨或聯(lián)合口服免疫小鼠,ELISA檢測免疫小鼠脾細胞分泌的細胞因子、血清中特異性抗體IgG及鼻咽部灌洗液中sIgG水平。復(fù)制小鼠肺炎鏈球菌D39株鼻咽部攜帶模型和腹腔侵襲性感染模型,觀察免疫小鼠鼻咽部肺炎鏈球菌D39菌落計數(shù)改變和腹腔攻擊小

10、鼠21天生存情況,以評價新型減毒沙門菌為載體的多價肺炎鏈球菌DNA疫苗的免疫原性及保護作用優(yōu)勢。
　　 3.采用分子遺傳學(xué)技術(shù)進一步分析肺炎鏈球菌基因工程疫苗優(yōu)勢抗原蛋白的分子進化特點及抗原多樣性。
　　 (1)采集上呼吸道共棲環(huán)境中的臨床收集輕鏈球菌家族菌株(包含肺炎鏈球菌、輕鏈球菌、口腔鏈球菌、血鏈球菌、嬰兒鏈球菌),PCR技術(shù)探查psaA基因分布情況。基于擴增的psaA基因進行氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建,分析p

11、saA的序列特點及在輕鏈球菌家族中可能的遺傳機制。
　　 (2)采集本地區(qū)臨床致病肺炎鏈球菌感染菌株,應(yīng)用PspA蛋白家族分型特異性引物PCR及生物信息學(xué)技術(shù)鑒定本地區(qū)臨床自然感染肺炎鏈球菌株P(guān)spA家族分布特點;進一步應(yīng)用分子遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建pspA基因多家族的系統(tǒng)發(fā)生樹,分析肺炎鏈球菌PspA作為新一代肺炎鏈球菌基因工程疫苗優(yōu)勢候選抗原應(yīng)包含的優(yōu)勢家族成分。
　　 結(jié)果:
　　 1.肺炎鏈球菌多價DNA疫苗的構(gòu)

12、建:成功擴增pspA基因包含抗原表位的N端片段及psaA基因目標片段,分別克隆入真核載體pcDNA3.1(+),構(gòu)建了PspA'-pcDNA3.1和PsaA-pcDNA3.1兩種肺炎鏈球菌毒力蛋白重組真核質(zhì)粒,并從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測了這兩種重組質(zhì)粒編碼的psaA及pspA'基因在哺乳動物細胞的成功表達。
　　 2.肺炎鏈球菌多價DNA疫苗的免疫原性及保護效能
　　 2.新型減毒沙門菌為載體的肺炎鏈球菌多價DNA疫苗免

13、疫原性及保護效能
　　 3.肺炎鏈球菌新一代基因工程疫苗優(yōu)勢靶抗原PsaA、PspA在鼻咽部微環(huán)境共棲同種群細菌中的分子遺傳學(xué)分析
　　 (1)肺炎鏈球菌psaA基因的種群基因起源進化分析提示psaA基因在臨床分離的輕鏈球菌群菌株中廣泛存在,但是僅僅在肺炎鏈球菌中該基因是垂直遺傳的,其它的輕鏈球菌群菌株中psaA基因可能來源于共生環(huán)境中基因的水平轉(zhuǎn)移,并且推測這些轉(zhuǎn)移的psaA基因之間的差異可能與BOX元件的參與及轉(zhuǎn)移后

14、發(fā)生的頻繁的基因內(nèi)重組現(xiàn)象相關(guān)。
　　 (2)肺炎鏈球菌pspA基因N端抗原多樣性區(qū)域基因組學(xué)分析提示本地區(qū)PspA蛋白家族分布趨勢:PspA-Faml-Clade2(31.0％)和PspA-Fam2-Clade3(47.6％)的菌株作為優(yōu)勢分布,與國外報道存在差異。
　　 結(jié)論:
　　 新型減毒沙門菌載體系統(tǒng)在保障重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性同時避免了抗性基因及減毒株毒力回復(fù)的安全問題,將其應(yīng)用于攜帶肺炎鏈球菌多價DNA疫

15、苗,激發(fā)了機體更全面的全身性免疫應(yīng)答,在肺炎鏈球菌的定植及侵襲性感染的動物模型中表現(xiàn)出了增強的保護效能,是一種具備良好應(yīng)用前景的肺炎鏈球菌基因工程疫苗優(yōu)化策略。
　　 肺炎鏈球菌基因工程疫苗的優(yōu)勢靶抗原psaA和pspA基因的抗原遺傳背景分析證實了這兩種抗原在肺炎鏈球菌的抗原特異性。但pspA基因在本地區(qū)肺炎鏈球菌株中的抗原多樣性現(xiàn)象提示:在進一步的肺炎鏈球菌基因工程疫苗靶抗原優(yōu)化策略中應(yīng)包含PspA優(yōu)勢家族抗原表位才能更全面的