肺炎鏈球菌蛋白（LytA）疫苗的制備及其相關臨床前期基礎研究.pdf

1、研究背景與目的：肺炎鏈球菌是一種較為常見的革蘭氏陽性致病菌，約40﹪～50﹪健康人群攜帶有肺炎鏈球菌。當機體抵抗力下降時，如麻疹等呼吸道病毒感染以后，營養(yǎng)不良或者老年體弱等情況下，肺炎鏈球菌將透過粘膜防御體系，從粘附部位下行至肺或者進入血液引起細菌性肺炎，以及中耳炎、菌血癥、腦膜炎等相關疾病。在英國，40﹪～50﹪的社區(qū)獲得性肺炎(community acquire pneumonia，CAP)以及20﹪的腦膜炎由它引起的。在美國，致命

2、性的肺炎鏈球菌感染病例每年約有40000例。由肺炎鏈球菌所引起的社區(qū)獲得性肺炎有著較高的死亡率，在不同的發(fā)達國家這一比例平均達到20﹪～50﹪左右，30﹪～60﹪幸存者都有不同程度的長期后遺癥，包括聽力喪失，神經(jīng)缺陷，以及神經(jīng)心理損傷。在我國，肺炎鏈球菌感染致病人群主要為兒童。一項對北京地區(qū)307名兒童咽試子細菌培養(yǎng)調(diào)查顯示，健康兒童中肺炎鏈球菌的平均帶菌率為18.6﹪，居各細菌之首。對各年齡組分別統(tǒng)計顯示，1～3歲組兒章帶菌率最高，為

3、29.5﹪；4～6歲組為18．7﹪；7～9歲組為8.62﹪；10～13.56﹪。隨著目前耐萬古霉素肺炎鏈球菌菌株的發(fā)現(xiàn)，更意味著抵抗該菌感染最后一道防線的喪失。而目前市場上廣為使用的莢膜多糖疫苗以及結(jié)合疫苗由于其固有的局限性，使得預防肺炎鏈球菌感染，特別是對高危人群(60歲以上的老人和5歲以下的幼兒)感染的預防變得更為困難。發(fā)展新一代蛋白質(zhì)疫苗以及抗原表位亞單位疫苗已經(jīng)成為必然而迫切的實際需要。 研究結(jié)果 一、按照《生物

4、制品規(guī)程》、《新生物制品審批辦法》以及中國發(fā)明專利申報相關要求，完成了肺炎鏈球菌LytA重組蛋白疫苗的制備及鑒定工作。 (1)擴增了兩端帶有完整酶切位點的LytA編碼基因片段，測序表明與構(gòu)建的序列與理論序列完全一致。 (2)完成了宿主菌和工程菌大體菌落形態(tài)、低倍鏡下觀、高倍鏡下觀、電鏡下觀察、藥敏反應、生化反應等鑒定為生物制品申報以及專利申請?zhí)峁┝吮仨毜幕緦嶒炇已芯抠Y料。電鏡觀察表明，本實驗室構(gòu)建的工程菌不具有菌毛和鞭

5、毛，為非致病性大腸桿菌。 (3)在誘導過程中，本實驗室所構(gòu)建的LytA重組質(zhì)粒具有良好的穩(wěn)定性，均在96﹪以上。 (4)將傳代后的第50、40、30、20、10代工程菌與原始種子工程菌進行生物化學與藥物敏感測定。結(jié)果經(jīng)對比分析后表明，多次無抗生素選擇壓力條件下培養(yǎng)傳代后其生物化學反應以及耐藥譜均沒有發(fā)生改變。 (5)本實驗室構(gòu)建的用于表達LytA的工程茵在pH為7.0的LB培養(yǎng)基、37℃、轉(zhuǎn)速為250rpm的條件

6、下?lián)u瓶培養(yǎng)1.5小時后即達到快速生長中期。 (6)在LB、SOB、TB、XY等不同培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)表達自溶酶融合蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)LB培養(yǎng)后目的蛋白在全菌蛋白中的表達量所占比例最大。 (7)誘導表達過程中，加入IPTG誘導后，LytA在25℃或者37℃的條件下有較高比例的表達，在25℃時表達比例較高一些，并且包涵體形成很少，主要以可溶性表達為主。 (8)在誘導表達中，當LB培養(yǎng)液的pH值處于6.8～7.0左右時，目

7、的蛋白有較高比例的表達。 (9)接種量在1﹪、5﹪、10﹪時其表達比例均較高，三者之間差別不大，考慮到純化表達過程中成本優(yōu)化問題，確定1﹪的接種量為最佳接種量。 (10)隨著裝液量的增加，蛋白表達的絕對量也呈增加趨勢，但是在40﹪的裝液量時其蛋白的表達比例最高。 (11)在25℃低溫誘導條件下，誘導2h、4h、6h、8h、10h后蛋白均有較為大量的表達，并且表達百分比趨于一致。為簡化表達純化工藝流程，降低成本，選

8、擇2h～4h為純化表達工藝中最佳誘導時間。 (12)綜合LytA表達純化過程中各種優(yōu)化條件的分析，確定了LytA表達的穩(wěn)定與最優(yōu)化體系，采用凝膠色譜、大孔徑碳柱分析，分析方法用HPLC面積歸一化法，測得蛋白疫苗混合組分中LytA主含量所占比例為95.7﹪。 (13)等電聚膠分析，測定LytA的實際PI為5.0。 (14)LytA氨基酸組成分析：對照理論百分比組成(來自于NCBI查詢結(jié)果)，發(fā)現(xiàn)實際含量最高者為As

9、p，最低者為Cys。除Asp、Thr、Glu、Gl y、Val、Leu、Arg外，其他基本相符，而差異最大的是Asp、Val這兩種氨基酸。 二、LytA重組蛋白疫苗可以誘導產(chǎn)生呼吸道粘膜sIgA的產(chǎn)生，動物實驗證明其安全性符合《新生物制品審批辦法》中相關要求。 (1)LytA進行初步的毒性安全實驗分析發(fā)現(xiàn)免疫后觀察七天，動物健存，體重增加，注射處無紅種，無結(jié)痂。 (2)與多糖疫苗免疫過的小鼠以及正常對照小鼠相比，

10、運用重組的LytA蛋白免疫后的小鼠，其血清中IgG、IgA抗體水平均特異性升高，sIgA在肺、鼻咽灌沈液中有較高水平，而在肺灌洗液中更高一些。 (3)經(jīng)肺組織大體觀察、病理組織切片觀察發(fā)現(xiàn)自溶酶蛋白免疫能為5種不同血清型(6B、6A、19F、23F、14)的肺炎鏈球菌感染的小鼠提供較好的免疫保護力。自溶酶蛋白免疫對19F血清型肺炎鏈球菌攻擊感染后小鼠的保護性很好，小鼠存活率達到80﹪。對23F、6B血清型肺炎鏈球菌攻擊感染后小鼠

11、的保護性較好，小鼠存活率達到60﹪。而對照組存活率僅為30﹪。FITC熒光標記抗體定位分析結(jié)果表明，LytA免疫后，在小鼠氣管粘膜表面、肺泡表面有、sIgA分布。為自溶酶蛋白免疫能誘導先天性免疫保護效應提供了一定的實驗依據(jù)。 三、成功預測并克隆構(gòu)建了含有多表位抗原基因的重組質(zhì)粒，實現(xiàn)了多表位抗原的成功表達，純化的抗原蛋白分子量為5kDa。 (1)綜合多種生物信息學預測工具的分析選定序列2～28(EINVSKLRTDLPQ

12、VGVQPYRQVHAHST)為可能的B細胞抗原表位，序列98～112(FMTDYRLYIELLRNL)為可能的T細胞抗原表位。并且預測的MHC-Ⅱ類分子結(jié)合肽序列與預測的B細胞抗原表位序列是重疊的。 (2)不同血清型肺炎鏈球菌LytA的抗原表位分布并不存在差異。 (3)重組表達載體的篩選和鑒定結(jié)果表明目的基因序列沒有發(fā)生移碼突變，重組表位的實際基因序列與理論設計完全一致。 (4)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-1<

13、,1>1<,2>誘導后SDS-PAGE電泳顯示，在沉淀樣品中出現(xiàn)一大小約為31kDa較粗的蛋白條帶，這是GST和插入其下游的5kDa的重組抗原表位L<,1>L<,2>所形成的融合蛋白。經(jīng)IPTG誘導的空載pGEX-4T-1大腸桿菌在26 kDa處出現(xiàn)一明顯條帶，為空載體誘導后所表達的GS7。蛋白。 小結(jié)按照《生物制品規(guī)程》、《新生物制品審批辦法》和中國發(fā)明專利申請要求，我們對本實驗室pGEX-4T-1質(zhì)粒、所構(gòu)建的LytA表達重

14、組質(zhì)粒穩(wěn)定性進行了鑒定。對宿主菌和工程菌的穩(wěn)定性、耐藥性、生化反應特性等進行了鑒定分析，并對LytA的相關理化性質(zhì)進行了鑒定。對LytA的保護性進行了進一步的驗證。結(jié)果顯示所構(gòu)建的重組質(zhì)粒、工程菌菌具有較高的穩(wěn)定性，適合運用于規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)，建立的LytA重組表達體系具有穩(wěn)定性、高效性的特點。本研究基本完成了肺炎鏈球菌LytA重組蛋白疫苗的臨床前期研究工作，有關內(nèi)容已經(jīng)申報發(fā)明專利(申請?zhí)枺?00710027897.7)。動物實驗表明