肺炎鏈球菌體蛋白LytA和CbpA對感染小鼠的診斷價(jià)值.pdf

1、目的：肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn）廣泛分布于自然界，為條件致病菌，40％～50%健康人群鼻咽部可攜帶本菌。當(dāng)機(jī)體處于免疫力低下狀態(tài)時(shí)，引起細(xì)菌性肺炎、腦膜炎、中耳炎以及敗血癥，在嬰幼兒和老年感染患者中具有一定的死亡率。據(jù)統(tǒng)計(jì)在發(fā)展中國家，每年約有120萬5歲以下的兒童死于肺炎鏈球菌引起的肺炎。肺炎鏈球菌感染性疾病的快速診斷實(shí)驗(yàn)對早期對癥治療，減少抗生素的濫用，降低發(fā)病率和死亡率具有重要的意義。

2、
　　 本研究通過基因工程技術(shù)獲取肺炎鏈球菌表面蛋白自溶素(LytA)和膽堿結(jié)合蛋白(CbpA)，探討其對肺炎鏈球菌感染小鼠的血清學(xué)診斷價(jià)值，為進(jìn)一步應(yīng)用于臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：1.1ytA和cbpA基因的原核表達(dá)及純化：根據(jù)GenBank中1ytA和cbpA基因保守序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，采用PCR技術(shù)從肺炎鏈球菌基因組中擴(kuò)增1ytA和cbpA保守序列片段；經(jīng)由IPTG誘導(dǎo)并通過等電點(diǎn)洗脫方法獲取純化的重

3、組蛋白LytA和CbpA;Westernblot測定表達(dá)蛋白的抗體結(jié)合活性。
　　 2．建立細(xì)菌感染小鼠模型：肺炎鏈球菌感染實(shí)驗(yàn)組及乙型鏈球菌感染對照組以血清直接凝集效價(jià)≥1:160判定為合格待測血清，用于后續(xù)ELISA測定。
　　 3．建立ELISA反應(yīng)模式：以LytA和CbpA為抗原，建立間接ELISA反應(yīng)模式，測定感染小鼠血清中相應(yīng)的IgG和IgM抗體，評(píng)價(jià)診斷價(jià)值。
　　 結(jié)果：1．成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體

4、pET-32a(+)-1ytA和pET-32a(+)-cbpA，表達(dá)的重組蛋白LytA和CbpA具有較好的抗體結(jié)合活性。
　　 2．成功建立細(xì)菌感染小鼠模型，確定感染血清標(biāo)本來源的可靠性。
　　 3．實(shí)驗(yàn)組小鼠（肺炎鏈球菌感染組）IgM和IgG類抗LytA抗體滴度高于對照組（正常對照組和乙型鏈球菌感染對照組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CbpA抗體與正常對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與乙型鏈球菌感染組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

5、P＞0.05)。CbpA蛋白對感染小鼠診斷的敏感性較高(IgG:83.3%;IgM:75%)，而LytA特異性較高(IgG:100%;IgM:100%)。
　　 結(jié)論：1．證實(shí)了機(jī)體受肺炎鏈球菌刺激后血清中會(huì)出現(xiàn)某些抗體，可以用作血清學(xué)診斷。
　　 2．通過基因工程技術(shù)獲取的重組蛋白LytA和CbpA具有良好的抗體結(jié)合活性，可用于血清學(xué)反應(yīng)。
　　 3．以重組蛋白LytA和CbpA為抗原建立的ELISA反應(yīng)模式可