黏膜、腹腔免疫nanA蛋白對(duì)小鼠肺炎鏈球菌感染保護(hù)效果及機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:
　　肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia，S.pn)能引起中耳炎、肺炎、腦膜炎和敗血癥等，主要感染兒童和老年人，并有很高的病死率。隨著人口老齡化和抗生素耐藥的加劇，和已上市兩代疫苗不斷出現(xiàn)的一些缺點(diǎn)，尋找能有效預(yù)防S.pn感染的蛋白抗原是疫苗發(fā)展的趨勢(shì)。
　　肺炎鏈球菌神經(jīng)氨酸酶可催化糖結(jié)合物釋放末端唾液酸殘基，使其暴露潛在的結(jié)合位點(diǎn)，并可為細(xì)菌新陳代謝提供糖的來源。在肺炎鏈球菌入侵時(shí)，它可以通

2、過去除入侵上皮細(xì)胞表面的硅酸位點(diǎn)，暴露下面的受體，從而增強(qiáng)S.pn在鼻咽部的定植能力，并有助于S.pn粘附和入侵人腦內(nèi)皮細(xì)胞。因此，本研究擬原核表達(dá)并純化肺炎鏈球菌神經(jīng)氨酸酶nanA蛋白，并在小鼠模型中探討其保護(hù)作用，評(píng)價(jià)其作為S.pn疫苗候選蛋白的可行性。
　　方法:
　　對(duì)肺炎鏈球菌D39菌株的nanA基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)出特異性引物，通過PCR擴(kuò)增后與pET28a(+)載體連接來構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒載體，后轉(zhuǎn)化大腸

3、埃希菌BL21(DE3)表達(dá)菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)細(xì)菌上清高效表達(dá)目的蛋白，并對(duì)重組蛋白經(jīng)Ni-NTA柱純化，獲得高純度的截短nanA蛋白。采用nanA蛋白抗原分別經(jīng)黏膜和腹腔免疫小鼠后，用不同血清型的肺炎鏈球菌，通過鼻腔和腹腔攻毒;采用鋪板計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)目的蛋白疫苗清除細(xì)菌在鼻咽部和肺部定植的能力，通過生存時(shí)間和生存率評(píng)價(jià)其對(duì)感染致死劑量S.pn小鼠的保護(hù)效應(yīng);采用ELISA法檢測(cè)其刺激宿主產(chǎn)生抗體種類、亞型及滴度以及細(xì)胞因子等指標(biāo)，同時(shí)檢測(cè)

4、正常人血清樣本中是否存在針對(duì)截短nanA的天然抗體。
　　結(jié)果:
　　構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-nanA，在E.coli BL21(DE3)中獲得了可溶性表達(dá)，純化后截短nanA蛋白純度達(dá)90％。將其腹腔免疫小鼠后，獲得了高效價(jià)的anti-nanA抗血清，且截短nanA蛋白在6株不同血清型的肺炎鏈球菌均有表達(dá)且相當(dāng)保守。將截短nanA抗原黏膜免疫小鼠后可產(chǎn)生高效價(jià)的S-IgA和IgG抗體，且小鼠脾細(xì)胞分泌的IL

5、-17A和IL-4的水平顯著增加。體內(nèi)試驗(yàn)也證實(shí)截短nanA抗原黏膜免疫小鼠后可以顯著降低19F型肺炎鏈球菌在宿主鼻咽部和肺部殘存的細(xì)菌數(shù)量。在肺炎鏈球菌致死性感染中，截短nanA抗原黏膜免疫小鼠后，可有效延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間，并提高其生存率。而腹腔免疫截短nanA抗原后，也可產(chǎn)生較高效價(jià)的IgG抗體，但效價(jià)低于黏膜免疫，體內(nèi)試驗(yàn)也表明腹腔免疫只能延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間，而不能有效降低小鼠死亡率。通過檢測(cè)健康兒童和健康成人血清中抗nanA的lg

6、G水平發(fā)現(xiàn)，健康成人中的anti-nanA IgG抗體水平顯著高于健康兒童中的水平。
　　結(jié)論:
　　肺炎鏈球菌截短nanA蛋白，在人群中具有免疫原性，在不同血清型S.pn中保守性好。其腹腔免疫小鼠的保護(hù)效應(yīng)不明顯，但粘膜免疫小鼠后可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫反應(yīng)和Th2、Th17型細(xì)胞免疫反應(yīng)，能顯著降低19F型肺炎鏈球菌在宿主鼻咽部和肺部殘存的細(xì)菌數(shù)量，有效延長(zhǎng)2型和3型S.pn致死性感染小鼠的生存時(shí)間，并提高其生存率，