SP2108、SP0148重組蛋白的原核表達(dá)及其對(duì)小鼠感染肺炎鏈球菌的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：構(gòu)建肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae, S.pn）sp2108、sp0148基因的原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化相應(yīng)的重組蛋白，分析其在6株國(guó)內(nèi)常見(jiàn) S.pn血清型菌株中的保守性；并將單個(gè)蛋白質(zhì)抗原經(jīng)不同途徑免疫 C57BL/6小鼠，檢測(cè)特異性抗體 IgG、IgA效價(jià)后，用不同血清型的S.pn攻毒免疫小鼠，從而探討 S.pn表面蛋白SP2108及SP0148對(duì)小鼠感染S.pn的保護(hù)作用，評(píng)價(jià)該表面蛋白對(duì)肺炎鏈

2、球菌感染的保護(hù)效果，為開(kāi)發(fā)更有效的S.pn蛋白疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:利用PCR法擴(kuò)增全長(zhǎng)sp2108、sp0148基因，將其分別克隆至pCold TF和ppSUMO質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)后IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA親和層析純化獲得較高純度的目的蛋白；將純化重組蛋白免疫 C57BL/6小鼠制備多克隆抗體，ELISA法檢測(cè)特異性 IgG效價(jià)后，通過(guò) Western Blotting鑒定其在6種常

3、見(jiàn)S.pn血清型菌株中的保守性。為了評(píng)估 SP2108、SP0148兩種重組蛋白對(duì)不同血清型 S.pn感染的保護(hù)效果，本實(shí)驗(yàn)用上述制備的純化重組蛋白抗原經(jīng)腹腔皮下多點(diǎn)注射免疫 C57BL/6小鼠，然后選擇國(guó)內(nèi)常見(jiàn)3種血清型的肺炎鏈球菌進(jìn)行腹腔攻毒研究。為了評(píng)價(jià) SP0148重組蛋白抗原對(duì) C57BL/6小鼠鼻腔感染 S.pn后的保護(hù)效果，通過(guò)模擬 S.pn自然感染的途徑，經(jīng)鼻腔滴注免疫小鼠后，用19F型菌株構(gòu)建鼻咽部定植模型，以評(píng)價(jià)其抗

4、S.pn定植的能力；同時(shí)選擇S.pn中致病能力最強(qiáng)的D39菌株進(jìn)行鼻腔攻毒，以構(gòu)建S.pn致死性肺炎的小鼠模型。此外，本實(shí)驗(yàn)采用特異性Anti-SP0148血清被動(dòng)注入小鼠腹腔后，用 D39型菌株進(jìn)行腹腔攻毒，以鑒定 SP0148重組蛋白抗原的保護(hù)效應(yīng)是否由其特異性抗血清介導(dǎo)。最后，本實(shí)驗(yàn)通過(guò) D39型菌株對(duì)肺癌 A549細(xì)胞粘附抑制實(shí)驗(yàn)，以分析不同濃度 SP0148重組蛋白及不同滴度 anti-SP0148血清對(duì)D39粘附于A549細(xì)

5、胞的影響。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建和表達(dá)SP2108、SP0148重組蛋白，Western Blotting分析證實(shí)， D39(2型)、TIGR4(4型)、CMCC( B)31693(19F型)、CMCC( B)31207(6B型)、CMCC( B)31203(3型)、ATCC(BAA-255) R6(2型)等6種S.pn菌株均能表達(dá)上述2種目的蛋白。經(jīng)腹腔皮下免疫接種SP2108重組蛋白后，未能對(duì)C57BL/6小鼠腹腔感染D39型S

6、.pn提供免疫保護(hù)效應(yīng)；而SP0148重組蛋白在腹腔免疫和粘膜免疫C57BL/6小鼠中均顯示出明顯的保護(hù)效果，且能夠提高小鼠生存百分比，延長(zhǎng)其生存時(shí)間。被動(dòng)免疫研究提示SP0148抗血清對(duì)小鼠腹腔感染S.pn具有明顯的保護(hù)作用。
　　粘附抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)，不同濃度SP0148重組蛋白和不同滴度的Anti-SP0148均能抑制D39型S.pn對(duì)A549細(xì)胞的粘附，且呈劑量依賴關(guān)系。此外，通過(guò)SP0148重組蛋白體外刺激鼻腔滴注該蛋白的小

7、鼠脾細(xì)胞，可引起細(xì)胞因子IL-17A和IFN-γ水平明顯上升，而細(xì)胞因子IL-4、IL-10的水平未發(fā)生明顯變化。在構(gòu)建的S.pn感染定植的小鼠模型中，SP0148重組蛋白通過(guò)鼻腔粘膜途徑免疫C57BL/6小鼠，能有效減少19F型S.pn在鼻咽部粘膜及肺組織的定植。
　　結(jié)論：SP0148、SP2108重組蛋白在不同血清型S.pn中均具有保守性高、免疫原性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本研究首次通過(guò)腹腔及鼻腔兩種不同途徑免疫C57BL/6小鼠，并進(jìn)一