肺炎鏈球菌表面粘附素A的原核表達(dá)和免疫保護(hù)性的初步研究.pdf

1、目的：肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S．P）廣泛分布于自然界，是一種條件致病菌，定植在40%健康人群鼻咽部，可以引起肺炎、中耳炎、菌血癥、腦膜炎等疾病。據(jù)統(tǒng)計在發(fā)展中國家，每年大約有500萬5歲以下的兒童死于肺炎鏈球菌引起的肺炎及腦膜炎。隨著抗生素的廣泛使用，肺炎鏈球菌對青霉素耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，且呈多重耐藥，嚴(yán)重影響治療效果，因此應(yīng)用疫苗進(jìn)行有效的預(yù)防顯得尤為重要。肺炎鏈球菌有90多個血清型，其中近30個

2、血清型對人有致病性，為細(xì)菌性肺炎的主要病原體。目前使用的疫苗多為型特異性多糖疫苗，難以覆蓋所有血清型，且對2歲以下嬰幼兒及老年人的保護(hù)效果不理想。因此，尋找新的候選疫苗是有效預(yù)防細(xì)菌性肺炎的關(guān)鍵。 肺炎鏈球菌表面黏附素A （PsaA）為肺炎鏈球菌的黏附分子，是該菌所有血清型共有的一種遺傳保守的、種特異性的表面蛋白抗原。PsaA在肺炎鏈球菌黏附呼吸道粘膜過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是主要的毒力因子之一。PsaA抗原決定簇全部或部分暴露于細(xì)

3、胞表面，具有較好的免疫原性。因此，PsaA蛋白有可能作為肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗的抗原，同時還有可能用于檢測患者血清中相應(yīng)的抗體，為肺炎鏈球菌感染的快速診斷提供依據(jù)。 本研究采取基因工程方法構(gòu)建重組載體，經(jīng)表達(dá)獲得PsaA蛋白，并利用動物主動免疫來初步驗證其保護(hù)作用，研究其作為疫苗抗原的可行性。 方法： 1．psaA基因的克隆、表達(dá)：利用PCR技術(shù)從肺炎鏈球菌基因組中擴(kuò)增psaA片段，克隆后構(gòu)建在原核表達(dá)載體pET

4、-32a中；經(jīng)測序與GenBank數(shù)據(jù)庫中肺炎鏈球菌全基因組的psaA片段進(jìn)行比對，將含有目的基因片段的重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，飽和硫酸銨純化蛋白；應(yīng)用SDS-DAGE電泳技術(shù)對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析，并用自制的小鼠抗血清進(jìn)行Western blot鑒定。 2．主動免疫實驗：將40只昆明小鼠隨機(jī)分為2組（每組20只），分別為生理鹽水對照組和PsaA實驗組。實驗組分別于0、1 4、21天經(jīng)腹股溝皮

5、下注射PsaA蛋白，劑量為10μg/只/次，對照組注射無菌生理鹽水。免疫結(jié)束后第7天對兩組小鼠經(jīng)腹腔感染致死劑量肺炎鏈球菌，連續(xù)監(jiān)測21天，進(jìn)行生存時間分析。 結(jié)果： 1．psaA基因的克隆、表達(dá)：經(jīng)快速PCR鑒定、酶切鑒定和基因測序結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌psaA基因片段被正確克隆到pET-32a原核表達(dá)載體中，核苷酸序列長度為870bp，與GenBank中相應(yīng)序列完全符合，無堿基突變；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組質(zhì)粒在BL21（

6、DE3）菌中表達(dá)出了分子量約為57kD的Trx-PsaA融合蛋白（PsaA蛋白約為37KD，硫氧還原蛋白約20KD），表達(dá)的蛋白以可溶形式為主，表達(dá)量約占全菌總蛋白的60%，飽和硫酸銨純化后純度大于80%；重組蛋白能夠與S．P免疫小鼠的抗血清發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。 2．重組蛋白PsaA的主動免疫實驗結(jié)果：以PsaA蛋白免疫的小鼠半數(shù)生存時間與對照組相比明顯延長（P<0．001）。 結(jié)論： 1．成功構(gòu)建了pET-32a-p