肺炎鏈球菌表面粘附素A(PsaA)蛋白抗原表位的預(yù)測(cè)、篩選及確定.pdf

1、肺炎鏈球菌（S. pneumoniae）是引起細(xì)菌性肺炎、腦膜炎、鼻竇炎和急性中耳炎等感染疾病的主要致病菌之一。根據(jù)其莢膜多糖分型系統(tǒng)可分為90余個(gè)血清型，其中約30個(gè)血清型為致病型。目前，臨床尚無較好的快速診斷肺炎鏈球菌感染的方法；而由于肺炎鏈球菌多重耐藥菌株的涌現(xiàn)，導(dǎo)致抗生素治療效果不佳。目前國內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛的肺炎鏈球菌23價(jià)多糖疫苗和7價(jià)糖蛋白結(jié)合疫苗存在血清型依賴、對(duì)高危人群保護(hù)不足和價(jià)格昂貴等缺陷。為此，開發(fā)新的臨床快速診斷

2、方法，研制新一代低成本、非血清型依賴、覆蓋所有人群的蛋白疫苗，具有較深遠(yuǎn)的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。
　　肺炎鏈球菌表面粘附素 A（PsaA）是一種多功能的表面結(jié)合脂蛋白，屬ABC型蛋白復(fù)合體，在肺炎鏈球菌粘附宿主細(xì)胞和致病過程中起著關(guān)鍵作用。PsaA蛋白分子結(jié)構(gòu)保守，具有較好的免疫原性，機(jī)體感染肺炎鏈球菌后可產(chǎn)生抗PsaA的特異性抗體并具有一定的免疫保護(hù)作用，因此是臨床免疫學(xué)診斷和新型蛋白疫苗的候選分子之一。
　　PsaA蛋白分

3、子量較大（約37 kDa），成分較復(fù)雜，存在一些與機(jī)體免疫反應(yīng)無關(guān)的成分。完整的PsaA蛋白無論是作為診斷抗原還是作為疫苗，其反應(yīng)的敏感性及特異性均不甚理想，且存在一定的危險(xiǎn)性。為解決這些問題，需深入了解PsaA蛋白分子的免疫學(xué)特性，以更安全、精準(zhǔn)、特異的單克隆抗體和亞單位疫苗為基礎(chǔ)，進(jìn)一步改進(jìn)臨床診斷的方法和蛋白疫苗的研制。
　　研究目的:本研究通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)肺炎鏈球菌表面粘附素 A（PsaA）蛋白分子的抗原 B細(xì)胞表位

4、和T細(xì)胞表位；以PsaA重組蛋白(rPsaA)免疫小鼠：利用間接ELISA方法篩選B細(xì)胞表位；利用雙夾心ELISA方法初步篩選T細(xì)胞表位再通過細(xì)胞內(nèi)染色及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)進(jìn)一步確定其 T細(xì)胞表位。本論文擬利用一系列的免疫學(xué)方法確定 PsaA蛋白分子的 B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位，為制備單克隆抗體和研制新型肺炎鏈球菌亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)，并提供完整的從預(yù)測(cè)、篩選到確定蛋白分子T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位的方法。
　　研究方法:
　　1.預(yù)

5、測(cè)PsaA蛋白抗原B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位并人工合成肽段:通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)肺炎鏈球菌 PsaA蛋白分子的 B細(xì)胞線性表位、MHCⅠ結(jié)合肽（CD8 T細(xì)胞表位）及MHCⅡ結(jié)合肽（CD4 T細(xì)胞表位），并人工合成相應(yīng)肽段。
　　2.構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-PsaA，表達(dá)、純化重組蛋白用以免疫小鼠:提取肺炎鏈球菌基因組 DNA，根據(jù)已知的 PsaA基因全長序列設(shè)計(jì)特異性引物，以全基因組 DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物定向克隆

6、至原核表達(dá)載體 pET28a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET28a-PsaA。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化、透析、去內(nèi)毒素、定量等步驟獲得 rPsaA蛋白，行SDS-PAGE分析，并用rPsaA蛋白免疫小鼠的血清進(jìn)行Western-blot鑒定。
　　3.間接ELISA方法篩選PsaA蛋白抗原B細(xì)胞表位:分別包被人工合成的候選 B細(xì)胞表位肽段（PB1~PB10），應(yīng)用間接 ELISA方法，檢測(cè)各肽段與 PBS免

7、疫組小鼠和rPsaA免疫組小鼠血清反應(yīng)水平，篩選出B細(xì)胞表位。
　　4.雙夾心ELISA、細(xì)胞內(nèi)IFN-γ染色及流式細(xì)胞技術(shù)確定T細(xì)胞表位:取 PBS免疫組小鼠和rPsaA免疫組小鼠脾及淋巴結(jié)細(xì)胞，分別與人工合成的 T細(xì)胞候選表位肽段（PⅠ1~PⅠ21，PⅡ1~PⅡ7）體外共培養(yǎng)3天，取上清進(jìn)行雙夾心ELISA檢測(cè)IFN-γ水平以初步篩選T細(xì)胞表位。用初步篩選陽性的MHCⅠ結(jié)合肽及 MHCⅡ結(jié)合肽分別刺激小鼠脾及淋巴結(jié)細(xì)胞后進(jìn)行染

8、色：MHCⅠ結(jié)合肽刺激的細(xì)胞表面染色 CD8分子，MHCⅡ結(jié)合肽刺激的細(xì)胞表面染色CD4分子，再進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)IFN-γ染色，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)。
　　研究結(jié)果:
　　1.生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)PsaA蛋白抗原細(xì)胞表位結(jié)果:整和各種預(yù)測(cè)方法的結(jié)果，得到10條候選 B細(xì)胞線性表位肽段，以PB1~PB10命名；21條候選 MHCⅠ結(jié)合肽，以PⅠ1~PⅠ21命名；7條候選MHCⅡ結(jié)合肽，以PⅡ1~PⅡ7命名，并成功進(jìn)行了人工合成。

9、>　　2.成功構(gòu)建了 pET28a-PsaA重組質(zhì)粒，表達(dá)、純化重組蛋白，免疫小鼠獲得抗重組蛋白多克隆抗體:以肺炎鏈球菌基因組 DNA為模板擴(kuò)增出 PsaA全長基因，約930bp，并將其克隆入 pET28a(+)載體，構(gòu)建 pET28a-PsaA重組質(zhì)粒，并經(jīng) PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　誘導(dǎo)表達(dá) rPsaA蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示 rPsaA蛋白約37kDa，與理論值符合。rPsaA蛋白純化后免疫小

10、鼠，Western-blot結(jié)果顯示 rPsaA多克隆抗體可識(shí)別rPsaA。
　　3.間接ELISA篩選出PsaA蛋白抗原B細(xì)胞表位:間接 ELISA結(jié)果顯示：肽段 PB2、PB6、PB7與 rPsaA免疫組組小鼠的血清發(fā)生反應(yīng)，其OD值顯著高于PBS免疫組組小鼠，確定其為B細(xì)胞表位。
　　4.雙夾心ELISA、細(xì)胞內(nèi)IFN-γ染色及流式細(xì)胞技術(shù)確定T細(xì)胞表位:雙夾心ELISA結(jié)果顯示肽段PⅠ10、PⅠ14、PⅠ17、PⅠ1

11、8、PⅠ21以及肽段PⅡ2、PⅡ5、PⅡ6刺激rPsaA免疫組小鼠細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ量顯著高于PBS免疫組，為初步篩選的結(jié)果；經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)進(jìn)一步確定：經(jīng)肽段PⅠ14、PⅠ17、PⅠ21刺激后，rPsaA免疫組小鼠細(xì)胞中IFN-γ和CD8雙陽性細(xì)胞的百分比較PBS免疫組小鼠細(xì)胞的百分比顯著升高，為CD8T細(xì)胞表位；經(jīng)肽段PⅡ2、PⅡ5刺激后，rPsaA免疫組小鼠細(xì)胞中IFN-γ和CD4雙陽性細(xì)胞百分比較PBS免疫組小鼠細(xì)胞的百分比

12、顯著升高，為CD4T細(xì)胞表位。
　　研究結(jié)論:
　　1.通過生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)了PsaA蛋白抗原B細(xì)胞和T細(xì)胞表位。
　　2.成功構(gòu)建了 pET28a-PsaA原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化了 rPsaA蛋白，免疫小鼠獲得抗重組蛋白多克隆抗體。
　　3.確定了肺炎鏈球菌PsaA蛋白分子的3個(gè)B細(xì)胞線性表位，2個(gè)CD4T細(xì)胞表位，3個(gè)CD8 T細(xì)胞表位，為研制肺炎鏈球菌新型蛋白疫苗及制備單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。