重組肺炎鏈球菌HMGR特性分析及抑制劑篩選.pdf

1、肺炎鏈球菌是引起腦膜炎、菌血癥、肺炎等疾病的主要致病菌，近年來由于環(huán)境污染和抗生素的亂用而造成多藥抗性的肺炎鏈球菌菌株逐年增加，對抗生素的抗性逐年增強(qiáng)。HMG-CoA還原酶（HMGR）是甲羥戊酸（mevalonate）途徑的限速酶，催化HMG-CoA還原為甲羥戊酸。本研究從肺炎鏈球菌基因組DNA中PCR擴(kuò)增出mvaA基因全長1275bp的完整編碼序列，將其克隆到pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamtH

2、I雙酶切分析并測序證實(shí)的陽性重組子亞克隆到pET-28a（+）表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。在30℃以1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Ni-NTA層析柱分離純化后經(jīng)SDS-PAGE分析表明在約47kD處有特異性表達(dá)帶。肺炎鏈球菌HMGR以NADPH作為輔酶，動力學(xué)分析采用紫外分光光度法檢測NADPH在340nm處吸收值的變化。檢測結(jié)果表明舯炎鏈球菌HMGR的最適pH約為6.5，最適溫度37℃。料酶提取物的比活為11.22U/mg

3、，分離純化后比活為31.98U／mg，比活提高2.8倍。在37℃，pH6.5時的Vmax和Km分別為62.1U／mg和260μM。羅伐他汀是HMGR的競爭性抑制劑，對肺炎鏈球菌}IMGR的抑制常數(shù)Ki為362μM。表達(dá)純化后的重組HMGR免疫新西蘭大白兔，提取抗血清，ELISA檢測其效價為1：320000，Western雜交證明HMGR具有特異性雜交條帶。 序列分析表明，HMGR主要存在兩類，Ⅰ類主要存在于真核生物和部分古細(xì)菌中

4、，Ⅱ類主要存在于原核生物和部分古細(xì)菌中。他汀類藥物是Ⅰ類HMGR的良好競爭性抑制劑，其Ki常數(shù)在nM范圍內(nèi)，但是他汀類藥物對Ⅱ類HMGR的抑制效果并不明顯，其Ki值在μM范圍內(nèi)。為了尋找更專一有效的針對Ⅱ類HMGR的競爭性抑制劑，本文以假單孢桿菌HMGR晶體結(jié)構(gòu)為模板，通過SYBYL7.0軟件，用同源模建的方法分析了肺炎鏈球菌HMGR的三維結(jié)構(gòu)，根據(jù)其同源模建和三維結(jié)構(gòu)篩選HMGR的競爭性抑制劑。用重組表達(dá)的肺炎鏈球菌HMGR，檢測篩選