肺炎鏈球菌組氨酸激酶(VicK)中藥單體抑制劑的抗菌作用研究.pdf

1、目的：
　　雙組份系統(tǒng)VicR/VicK是肺炎鏈球菌中唯一一個(gè)與細(xì)菌生存相關(guān)的TCS系統(tǒng)，調(diào)控著維持細(xì)胞壁穩(wěn)態(tài)的基因表達(dá)，而且調(diào)節(jié)細(xì)菌對抗生素的耐藥性。其中VicK為含449個(gè)氨基酸的組氨酸激酶受體，負(fù)責(zé)接收外界信號刺激并將信號傳遞給VicR，被認(rèn)為是篩選抗菌藥物的良好作用靶點(diǎn)。
　　目前已有多篇以VicK為靶點(diǎn)篩選抗菌藥物的文章報(bào)道，本課題組以前也以該靶點(diǎn)篩選出6個(gè)具有抗肺炎鏈球菌作用的小分子化合物。而中藥單體作為我國傳統(tǒng)

2、藥物，來源廣泛且副作用小，是很好的抗菌藥物篩選庫，實(shí)驗(yàn)室前期以肺炎鏈球菌VicK為靶點(diǎn)通過計(jì)算機(jī)虛擬篩選獲得96種中藥單體，本研究將對這些化合物的抗菌作用進(jìn)行體內(nèi)外驗(yàn)證，同時(shí)對其相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　方法：
　　通過原核表達(dá)技術(shù)從大腸桿菌中表達(dá)S.pn VicK全長蛋白，經(jīng)Western blot分析VicK在6種不同血清型肺炎鏈球菌中的保守性并通過試劑盒檢測其激酶活性。然后利用具有活性的VicK蛋白對化合物進(jìn)行體

3、外篩選，以抑制VicK蛋白激酶活性的化合物進(jìn)行隨后的抑菌實(shí)驗(yàn)。采用最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)評估化合物的體外抗菌，利用細(xì)胞毒性試驗(yàn)評價(jià)其細(xì)胞毒性，采用小鼠S.pn鼻咽部定植模型和敗血癥模型評估化合物體內(nèi)抗菌作用，分別以感染部位細(xì)菌載量和生存率為評價(jià)指標(biāo)。采用微量棋盤稀釋法檢測其與傳統(tǒng)抗菌藥是否具有協(xié)同效應(yīng)，并從細(xì)菌形態(tài)變化和生物膜形成的角度初步探索其抗菌的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　試驗(yàn)中的5種中藥單體化合物

4、為:甲硫腺苷、octanal2，4-dinitrophenylhydrazone、去氧紫草素、麻醉椒苦素、沒食子酸月桂酯，其對VicK的ATPase酶活性具有顯著的抑制效應(yīng)，抑制率均大于50％。體外抑菌作用結(jié)果顯示，這5中化合物對肺炎鏈球菌的MIC分別為37.1，38.5，17，68.5，and21μg/mL，而體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5種化合物均能顯著延長感染小鼠的生存時(shí)間。同時(shí)這5種化合物對耐藥性肺炎鏈球菌、變形鏈球菌、緩癥鏈球菌、化

5、膿鏈球菌假肺炎均具有抗菌作用，其中去氧紫草素和沒食子酸月桂酯對MRSA也有顯著抗菌作用?？咕鷻C(jī)制研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在sub-MIC下，5種化合物都能抑制細(xì)菌細(xì)胞分裂和生物膜的形成。傳統(tǒng)抗菌藥增效實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去氧紫草素和沒食子酸月桂酯與青霉素、紅霉素和四環(huán)素都有協(xié)同作用，能夠降低耐藥型19F、19A S.pn在鼻咽部和肺部的定植。細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示5種化合物的細(xì)胞毒性較低。
　　結(jié)論：
　　5種中藥單體化合物為VicK蛋白抑制