DFI體內(nèi)篩選肺炎鏈球菌致腦膜炎相關(guān)基因.pdf

1、盡管抗生素治療已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，細(xì)菌性腦膜炎仍是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生最頻繁，最嚴(yán)重的感染性疾病，其比例至少占腦膜炎總數(shù)的60％以上。引起細(xì)菌性腦膜炎最常見(jiàn)的三種病原菌依次為流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌。目前對(duì)于肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae，S.pn)引起腦膜炎的機(jī)制并未完全清楚，因此發(fā)現(xiàn)S.pn致腦膜炎相關(guān)的毒力基因，不僅有助于進(jìn)一步理解其致病機(jī)理，還可為新藥開(kāi)發(fā)和研發(fā)新型蛋白類(lèi)疫苗提供候選基因。

2、 細(xì)菌進(jìn)入宿主體內(nèi)就如同進(jìn)入一個(gè)生存競(jìng)爭(zhēng)的“戰(zhàn)場(chǎng)”，要在體內(nèi)生存就必須表達(dá)一些使自身毒力增強(qiáng)或?qū)λ拗鲹p傷加劇的基因，因此細(xì)菌在宿主體內(nèi)表達(dá)的基因往往就是與致病緊密相關(guān)的毒力基因。本研究利用小鼠腦膜炎模型和差異熒光誘導(dǎo)技術(shù)(differential fluorescenceinduction，DFI)，在體內(nèi)大規(guī)模地篩選鑒定在肺炎鏈球菌性腦膜炎感染過(guò)程中表達(dá)或表達(dá)增強(qiáng)的基因，這些基因很可能就是肺炎鏈球菌引起腦膜炎的相關(guān)基因，在很大程

3、度上影響著肺炎鏈球菌通過(guò)血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的侵襲力。研究?jī)?nèi)容包括以下四個(gè)部分。 1．肺炎鏈球菌性腦膜炎動(dòng)物模型的建立。將凍存的TIGR4在新鮮TSA血平板上培養(yǎng)16～18h后，刮取細(xì)菌并稀釋成三種不同密度的菌液，每種密度分成2份，其中一份加入一定量的透明質(zhì)酸酶，另一份不加。對(duì)小鼠行淺麻醉，用卡介苗注射器將上述菌懸液緩緩逐滴滴至小鼠鼻腔處，待其自動(dòng)吸入，每只小鼠50μl。每天觀察小鼠情況，于

4、感染后24h、48h和72h處死小鼠，取心臟血和一半腦組織勻漿做細(xì)菌計(jì)數(shù)，另一半腦組織用于組織病理學(xué)檢查。結(jié)果表明：①透明質(zhì)酸酶并不能促進(jìn)鼻腔滴注TIGR4致小鼠腦膜炎的發(fā)生；②小鼠腦膜炎的發(fā)生率與鼻腔感染TIGR4劑量有關(guān)，3×10<'7>CFU已足夠，但低于該劑量腦膜炎的發(fā)生率會(huì)大大降低；③小鼠嗜睡、弓背癥狀與腦組織病理學(xué)改變顯著相關(guān)。模擬S.pn在人類(lèi)感染途徑，通過(guò)鼻腔滴注TIGR4．成功建立了小鼠腦膜炎模型，并且證實(shí)小鼠可出現(xiàn)嗜

5、睡、弓背等腦膜炎典型癥狀，為下一步研究S.pn致腦膜炎的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 2．肺炎鏈球菌綠色熒光蛋白報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及評(píng)價(jià)。DFI是以綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)告基因的篩選病原菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因的技術(shù)，必須要構(gòu)建一個(gè)可高效報(bào)告基因表達(dá)的綠色熒光蛋白報(bào)告質(zhì)粒。質(zhì)粒pGreeffrIR含有SD序列和翻譯增強(qiáng)子ENH及無(wú)啟動(dòng)子的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(gfp)，將其中的SD-ENH-GFP片段經(jīng)BamH Ⅰ酶切后插入含氯霉素抗性基因的自

6、殺質(zhì)粒pEVP3中，構(gòu)建了以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因的自殺質(zhì)粒pEVP3-SDGFP。為了評(píng)價(jià)新建質(zhì)粒pEVP3-SDGFP報(bào)告上游基因表達(dá)的情況，我們將肺炎鏈球菌的溶血素基因(pneumolysin，ply)上游約500bp片段插入到該質(zhì)粒報(bào)告基因上游的多克隆位點(diǎn)中，得到質(zhì)粒pEVP3-SDGFP-Ply，將其轉(zhuǎn)化入肺炎鏈球菌TIGR4中，由于溶血素基因在體內(nèi)、外均可表達(dá)，通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其不但可以報(bào)告肺炎鏈球菌溶血素基因的表達(dá)，并

7、且比已有質(zhì)粒pEGFP-1報(bào)告上游基因表達(dá)的能力顯著增強(qiáng)。表明構(gòu)建的肺炎鏈球菌綠色熒光蛋白報(bào)告質(zhì)粒pEVP3-SDGFP可以用于DFI篩選肺炎鏈球菌腦組織內(nèi)誘導(dǎo)基因所需的啟動(dòng)子誘捕文庫(kù)的構(gòu)建。 3．肺炎鏈球菌啟動(dòng)子誘捕文庫(kù)的構(gòu)建與初步分析。用DFI篩選病原菌體內(nèi)誘導(dǎo)的基因，首先要構(gòu)建一個(gè)包含無(wú)啟動(dòng)子序列的報(bào)告基因的啟動(dòng)子誘捕文庫(kù)。以第一部分構(gòu)建的自殺質(zhì)粒pEVP3-SDGFP為骨架，將Sau3AI酶切的肺炎鏈球菌基因組DNA隨機(jī)

8、片段(200～800bp)克隆到此載體GFP基因上游的BglⅡ位點(diǎn)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得了約58 000個(gè)重組子，提取質(zhì)粒，即為含有肺炎鏈球菌基因組DNA隨機(jī)酶切片段的質(zhì)粒庫(kù)。考慮到DNA片段的插入方向和大小(200～800bp，平均400bp)，該質(zhì)粒庫(kù)大約覆蓋肺炎鏈球菌基因組全長(zhǎng)(2.2Mb)的5倍，插入率達(dá)到90％以上，且有較強(qiáng)的隨機(jī)性，質(zhì)量較高。將該質(zhì)粒庫(kù)轉(zhuǎn)化入肺炎鏈球菌TiGR4菌株，獲得包含約500 000個(gè)

9、肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化子的菌株庫(kù)。經(jīng)過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，其包含插入了S.pn體內(nèi)、外表達(dá)基因片段的細(xì)菌，可以報(bào)告在特定條件下的基因表達(dá)，并且可通過(guò)流式細(xì)胞儀識(shí)別、分選。該文庫(kù)的成功構(gòu)建為進(jìn)一步利用差異熒光誘導(dǎo)技術(shù)篩選肺炎鏈球菌腦組織內(nèi)誘導(dǎo)基因奠定了良好的基礎(chǔ)。 4．小鼠腦組織中誘導(dǎo)表達(dá)的S.pn基因的篩選及生物信息學(xué)分析。將構(gòu)建好的肺炎鏈球菌菌株庫(kù)鼻腔滴注感染BALB/c小鼠，出現(xiàn)嗜睡、弓背等腦膜炎癥狀后取小鼠腦組織，勻漿，流式細(xì)胞儀

10、分選(fluorescence-activated cell sirting，F(xiàn)ACS)收集腦組織內(nèi)有熒光的細(xì)菌，體外培養(yǎng)一定時(shí)間后，再用流式細(xì)胞分選術(shù)剔除那些在體外也表達(dá)熒光的細(xì)菌，收集無(wú)熒光表達(dá)的細(xì)菌，得到只在腦組織內(nèi)發(fā)熒光的細(xì)菌，經(jīng)過(guò)兩輪篩選，最后我們共挑取220個(gè)菌落進(jìn)行進(jìn)一步分析。為了克隆這些細(xì)菌中包含的腦組織內(nèi)誘導(dǎo)基因的片段，我們應(yīng)用酶切自連法，即提取這些菌株的染色體DNA，用BamHⅠ酶切，并自身環(huán)化，使整合到染色體上的重

11、組自殺質(zhì)粒脫落下來(lái)并重新環(huán)化。對(duì)插入的隨機(jī)片段進(jìn)行測(cè)序后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，共證實(shí)有24個(gè)不同的基因片段，在TIGR4全基因組里面，這24個(gè)基因片段所處的操縱元結(jié)構(gòu)中，總共包括51個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中多數(shù)為含有多個(gè)ORFs的操縱元結(jié)構(gòu)。這些基因包括參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、DNA復(fù)制與重組、細(xì)胞壁合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、離子攝取以及功能未知的基因，其中有些基因的功能已有一些初步的研究，但其在腦膜炎發(fā)生過(guò)程中的作用并不清楚，如cb