篩選受轉(zhuǎn)化調(diào)控的肺炎鏈球菌毒力基因.pdf

1、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是一種常見的革蘭陽性條件致病菌，可引起肺炎、中耳炎、菌血癥、腦膜炎等嚴(yán)重疾病。在全球有很高的發(fā)病率和死亡率。老人、兒童以及艾滋病和先天免疫缺陷的患者是嚴(yán)重S.pn感染的高危人群。由于S.pn抗生素耐藥率的增加和目前疫苗的缺陷性，使得其感染的后果非常嚴(yán)重。因此要想從根本上解決S.pn的防治問題，就要深入了解其致病的分子機(jī)制，為研發(fā)新的藥物和疫苗提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2、 轉(zhuǎn)化是細(xì)菌之間基因轉(zhuǎn)移的一種方式，有現(xiàn)象提示肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化可能與細(xì)菌的毒力、耐藥相關(guān)。本研究利用差異熒光誘導(dǎo)技術(shù)(differential fluorescence induction，DFI)，在體內(nèi)大規(guī)模地篩選鑒定肺炎鏈球菌受轉(zhuǎn)化調(diào)控的毒力基因，這些基因很可能是肺炎鏈球菌條件致病過程中的重要基因。研究內(nèi)容包括以下三個(gè)部分。 1.肺炎鏈球菌啟動子誘捕文庫的構(gòu)建與初步分析。用DFI篩選病原菌體內(nèi)誘導(dǎo)的基因，首先要構(gòu)建一個(gè)

3、包含無啟動子序列的報(bào)告基因的啟動子誘捕文庫。以本課題組已構(gòu)建的自殺質(zhì)粒pEVP3-SDGFP為骨架，將Sau3A I酶切的肺炎鏈球菌基因組DNA隨機(jī)片段(200～800bp)克隆到此載體gfp基因上游的BglⅡ位點(diǎn)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得了約47000個(gè)重組子，提取質(zhì)粒，即為含有肺炎鏈球菌基因組DNA隨機(jī)酶切片段的質(zhì)粒庫?？紤]到DNA片段的插入方向和大小(200～800bp，平均500bp)，該質(zhì)粒庫大約覆蓋肺炎鏈球菌基因

4、組全長(2.2Mb)的5倍，插入率達(dá)到90％以上，且有較強(qiáng)的隨機(jī)性，質(zhì)量較高。將該質(zhì)粒庫轉(zhuǎn)化入S.pn TIGR4菌株，獲得包含約500 000個(gè)S.pn轉(zhuǎn)化子的菌株庫。經(jīng)過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，其包含插入了S.pn條件表達(dá)基因片段的細(xì)菌，可以報(bào)告在特定條件下的基因表達(dá)，并且可通過流式細(xì)胞儀識別、分選。該文庫的成功構(gòu)建為進(jìn)一步利用差異熒光誘導(dǎo)技術(shù)篩選S.pn體內(nèi)誘導(dǎo)基因奠定了良好的基礎(chǔ)。 2.DFI篩選小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的S.pn基

5、因及生物信息學(xué)分析。將構(gòu)建好的S.pn菌株庫腹腔注射感染BALB/c小鼠，24h后取小鼠心臟血和肺組織，分離出細(xì)菌，利用熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)分選收集有熒光的細(xì)菌，最后共挑取64個(gè)菌落進(jìn)行生物信息學(xué)分析。首先我們應(yīng)用酶切自連法，即提取這些菌株的染色體DNA，用BamH Ⅰ酶切，并自身環(huán)化，使整合到染色體上的重組自殺質(zhì)粒脫落下來并重新環(huán)化。然后對插入的隨機(jī)片

6、段進(jìn)行測序后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，共證實(shí)有10個(gè)不同的基因片段，其中8個(gè)從血液中篩出，2個(gè)從肺組織中篩出。對這10個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)基因片段進(jìn)行開放讀碼框(ORF)的搜索，總共發(fā)現(xiàn)18個(gè)ORFs，7個(gè)為單獨(dú)的ORF，3個(gè)為含有多個(gè)ORFs的操縱子結(jié)構(gòu)，這些基因包括參與能量(糖)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞壁合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、編碼表面錨定蛋白以及功能未知基因。這些基因可能S.pn致病相關(guān)，可用于下一步研究其是否受轉(zhuǎn)化調(diào)控。 3.肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化缺

7、陷菌的構(gòu)建和分析。對含上述10個(gè)基因片段的S.pn菌株，分別構(gòu)建其轉(zhuǎn)化缺陷菌；將轉(zhuǎn)化缺陷前、后的S.pn菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，腹腔注射感染BALB/c小鼠；24h后取小鼠心臟血和肺組織，分離出細(xì)菌，流式細(xì)胞儀分析S.pn菌株轉(zhuǎn)化缺陷前后熒光表達(dá)情況。共觀察到3株轉(zhuǎn)化缺陷后的細(xì)菌不表達(dá)熒光，因此其包含的3個(gè)基因片段是受轉(zhuǎn)化調(diào)控的，它們都是從血液中篩出，對照上部分生物信息學(xué)分析結(jié)果，這3個(gè)基因片段分別參與能量代謝、物質(zhì)運(yùn)輸和未知功能基因，對