上海地區(qū)致病性豬鏈球菌及其毒力基因的檢測(cè).pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)是一種重要的人畜共患病病原，根據(jù)菌體莢膜多糖抗原性的不同，分為35個(gè)血清型(1-34型，1/2型)。世界范圍內(nèi)以SS2(Streptococcus suis type 2)流行最廣，致病性最強(qiáng)，其次是1型、7型和9型。尤其是豬鏈球菌2型流行范圍最廣，對(duì)豬的致病性最強(qiáng)，而且可引起人的感染并致死。除SS2外,SS9主要在德國(guó)、比利時(shí)、西班牙、荷蘭等地流行；芬蘭以SS7最為流行。國(guó)內(nèi)199

2、1年在廣東省首次分離鑒定到SS2，隨后于1998年和2005年分別在江蘇和四川部分地區(qū)暴發(fā)人感染SS2并致人死亡，危害嚴(yán)重。不同血清型的地區(qū)分布不同。 上海地區(qū)是全國(guó)大規(guī)模豬養(yǎng)殖場(chǎng)較多的地區(qū)，是生豬輸出、輸入較大的城市，因此及時(shí)掌握上海地區(qū)致病性豬鏈球菌及其毒力因子的流行病學(xué)，為以后預(yù)防和控制大規(guī)模暴發(fā)豬鏈球菌具有重要的意義。 2005年-2007年期間，以上海市畜牧獸醫(yī)站日常豬病門診為基礎(chǔ)，部分規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)鼻拭子采樣

3、為輔，對(duì)上海地區(qū)主要致病性豬鏈球菌及其毒力因子進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。 首先對(duì)采的樣品中進(jìn)行鏈球菌分離，根據(jù)培養(yǎng)特性及形態(tài)、染色情況，分離鑒定了306株豬源鏈球菌，并對(duì)其進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。根據(jù)豬鏈球菌16SrRNA和gdh(谷氨酸脫氫酶)基因設(shè)計(jì)合成引物，建立的二重PCR，結(jié)合乳膠凝集試驗(yàn)對(duì)所分離的306豬源鏈球菌進(jìn)行豬鏈球菌和鏈球菌A-G群鑒定，并對(duì)鑒定出的豬鏈球菌進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)。鑒定結(jié)果表明：門診分離的214株中，C群鏈球菌為主要致病菌

4、(87株，占40.7％)，豬鏈球菌次之(28株，占13.1％)，A群鏈球菌有4株，占1.9％；B群鏈球菌有16株，占7.4％；D群鏈球菌有18株，占8.4％；E群鏈球菌有14株，占6.5％；另外未能定型有47株，占22％。豬場(chǎng)鼻拭子分離的92株中，豬鏈球菌4株，占4.4％；D群鏈球菌有52株，占56.5％；另外未能定型有36株，占39.1％。 然后根據(jù)豬鏈球菌6種主要致病性血清型(1型、1/2型、2型、7型、9型和14型)菌株莢

5、膜多糖的編碼基因CPS1I，CPS2J，CPS7H，CPS9H的核酸序列的設(shè)計(jì)合清型分型。檢測(cè)結(jié)果表明：8株SS2(8/32)、3株SS1(3/32)、2株SS7(2/32)、2株SS9(2/32)，17株SS其它血清型。對(duì)SS1、SS2、SS7、SS9共15株菌株進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)100％，與GenBank發(fā)表的序列的同源性均在99％以上。根據(jù)豬鏈球菌7種主要毒力基因谷氨酸脫氫酶國(guó)(gdh)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(

6、gapdh)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白(fpbs)和毒力相關(guān)基因orf2，設(shè)計(jì)并合成7對(duì)引物，通過(guò)組合優(yōu)化設(shè)計(jì)，建立豬鏈球菌7種主要毒力因子的兩組多重PCR檢測(cè)方法，并對(duì)分離到的32株豬鏈球菌和12株實(shí)驗(yàn)室豬鏈球菌保存菌株進(jìn)行毒力基因檢測(cè)。結(jié)果表明：SS2大部分均具有7種毒力因子，SS1、SS7、SS9和其他血清型的豬鏈球菌也均具有部分毒力因子。32株豬鏈球菌中，mrp

7、檢出率為25％(8/32)、epf檢出率為21.9％(7/32)、sly檢出率為25％(8/32)、gdh檢出率為100％(32/32)，gapdh檢出率為100％(32/32)、orf2檢出率為78.3％(25/32)、fbps檢出率為25％(8/32)。15株上海分離株毒力因子的測(cè)序結(jié)果與GenBank發(fā)表的序列的同源性均在95％以上，12株實(shí)驗(yàn)室保存菌株毒力因子的檢測(cè)結(jié)果與已知的背景材料一致。 為進(jìn)一步研究所分離到的4種主

8、要致病性血清型菌株致病力，探討毒力基因和菌株致病力之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)建立了斑馬魚(Danio rerio)和新西蘭白兔動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?shí)驗(yàn)結(jié)果表明：豬鏈球菌4種主要致病性血清型中，SS2對(duì)斑馬魚和新西蘭白兔均具有致病力，而SS1、SS7、SS9三種血清型對(duì)斑馬魚和新西蘭白兔致病力弱。因此上海地區(qū)分離的SS2菌株，不僅對(duì)豬有強(qiáng)致病性，對(duì)斑馬魚和新西蘭白兔也具有致病性，而SS1、SS7、SS9這3種血清型菌株對(duì)新西蘭白兔和斑馬魚致病性較弱，這