豬鏈球菌安徽株分離鑒定與RfeA蛋白對(duì)小鼠免疫保護(hù)性.pdf

1、豬鏈球菌病是由豬鏈球菌引起的豬的多種疾病的總稱，屬國(guó)家規(guī)定的二類動(dòng)物疫病，是一種在世界范圍內(nèi)傳播的、人畜共患傳染病，臨床表現(xiàn)為急性出血性敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、孕豬流產(chǎn)、仔豬下痢等，感染特定人群發(fā)病，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡，該病給我國(guó)乃至全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生安全。豬鏈球菌病病原為S.suis，依據(jù)莢膜多糖分型可分為35個(gè)血清型（1～34型，1/2型），其中世界范圍內(nèi)流行最廣的是豬鏈球菌2型，1型、7型、9

2、型對(duì)豬有較強(qiáng)致病性，臨床分離較多。由于血清型眾多加之型與型之間毒力和致病性差異較大，且毒力因子及致病機(jī)理尚不十分清楚，型間交叉保護(hù)力差，這些成為豬鏈球菌病防治和疫苗研制工作的難題。因此尋找有效且交叉保護(hù)性好的保護(hù)性抗原有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究主要包括以下部分：
　　1.豬鏈球菌安徽分離株血清型、毒力基因分布檢測(cè)
　　針對(duì)2009～2013年安徽地區(qū)87株豬鏈球菌，通過(guò)菌落培養(yǎng)生長(zhǎng)特征、實(shí)驗(yàn)室革蘭氏染色鏡檢，PCR分子生物學(xué)

3、分型方法對(duì)血清型、毒力基因分布進(jìn)行檢測(cè)分析。其中2型豬鏈球菌24株，1型豬鏈球菌10株，7型豬鏈球菌11株，分別占27.6％，11.5%，12.6%的比例，無(wú)豬鏈球菌9型。提示在安徽省豬鏈球菌2型占有最大比例，為優(yōu)勢(shì)菌型。16株2型豬鏈球菌株中毒力基因型為mrp+epf+sly+，占2型豬鏈球菌總數(shù)的66.7%。1型菌株HJ25毒力基因型為mrp+epf+sly+，而7型沒(méi)有該毒力基因型。分離于腦部和關(guān)節(jié)液中的2型豬鏈球菌，毒力基因型均

4、為mrp+epf+sly+，與文獻(xiàn)報(bào)道中毒力較強(qiáng)的豬鏈球菌基因型一致，也是目前公認(rèn)的強(qiáng)毒株所必需的毒力基因表型。
　　2.1型(HJ25)、2型(HJ15)、7型(CZ1)毒力檢測(cè)及致病性研究。
　　選取毒力基因型為mrp+epf+sly+的1型、2型豬鏈球菌HJ25、HJ15，7型豬鏈球菌株 CZ1，寇氏法測(cè)定其半數(shù)致死量（LD50），2型菌株 HJ15毒力最高（LD50值為4.47×107CFU），1型豬鏈球菌HJ25毒

5、力最低（LD50值為1.41×109CFU），三株菌同時(shí)攻毒小白鼠，通過(guò)病理切片觀察其致病性。三種不同型的豬鏈球菌造成的主要病變特征表現(xiàn)在肺臟組織，提示豬鏈球菌主要感染呼吸系統(tǒng)，致死機(jī)理有可能與豬鏈球菌侵襲肺臟等多器官，造成小葉性肺炎，導(dǎo)致小鼠呼吸困難，從而引起死亡有關(guān)。
　　3.豬鏈球菌分泌性蛋白R(shí)feA基因的克隆、表達(dá)及免疫保護(hù)性研究。
　　參照GenBank登陸的豬鏈球菌2型菌株05ZYH33的RfeA基因序列，設(shè)計(jì)合

6、成一對(duì)特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增1型，2型、7型豬鏈球菌RfeA全基因，擴(kuò)增結(jié)果顯示，7型豬鏈球菌未擴(kuò)增到目的基因，將目的基因克隆至pET-32a原核表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a-RfeA,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21中誘導(dǎo)表達(dá) RfeA蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳可見(jiàn)大小約為38kD的目的蛋白。免疫印跡顯示重組蛋白有免疫活性，目的蛋白純化后加弗氏佐劑乳化，分別于第1天、第14天、第21天免疫小鼠并用間接ELISA方法檢測(cè)免疫前

7、、免疫后不同免疫期小鼠血液中IgG抗體水平和細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-2含量，結(jié)果顯示一免、二免、三免后IgG抗體水平升高，二免后效價(jià)達(dá)到1:2097075200，IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-2含量均有升高，且在二免后與對(duì)照組相比有顯著升高。三免后一周用1型、2型、7型豬鏈球菌以絕對(duì)致死劑量對(duì)RfeA重組蛋白免疫組及對(duì)照組的小鼠進(jìn)行腹腔攻毒，結(jié)果顯示，RfeA重組蛋白對(duì)1型保護(hù)力100%，2型保護(hù)力80