肺炎鏈球菌感染在實(shí)驗(yàn)性哮喘中的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　支氣管哮喘是兒童最常見慢性氣道炎癥性疾病，其發(fā)病原因尚不清楚。盡管病毒感染與哮喘密切相關(guān)，但不能解釋所有哮喘過程，細(xì)菌性鼻竇炎、細(xì)菌性支氣管炎致哮喘癥狀加重，抗生素治療慢性鼻竇炎使哮喘癥狀改善，發(fā)生呼吸道感染時(shí)哮喘兒童比非哮喘兒童更多的使用抗生素治療才能控制哮喘，提示細(xì)菌感染在哮喘發(fā)病中有重要作用。
　　哮喘在兒童時(shí)期最常見，多數(shù)成人哮喘也在嬰幼兒時(shí)期起病，提示生命早期歷程在哮喘發(fā)病中有重要影響。目前越來越

2、多研究表明生命早期細(xì)菌感染與以后哮喘發(fā)生相關(guān):孕期母親患慢性絨毛膜羊膜炎，孩子7歲前反復(fù)喘息及患哮喘風(fēng)險(xiǎn)增高;分娩時(shí)母親子宮有鏈球菌、厭氧菌感染，后代17歲時(shí)哮喘風(fēng)險(xiǎn)顯著增加;1歲內(nèi)反復(fù)呼吸道細(xì)菌感染是哮喘危險(xiǎn)因素。
　　肺炎鏈球菌是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染最常見細(xì)菌病原體，也是哮喘患者呼吸道常見分離菌。Bisgaard等發(fā)現(xiàn)健康新生兒呼吸道有肺炎鏈球菌攜帶或感染，以后發(fā)生持續(xù)喘息、急性重癥喘息和因哮喘住院的風(fēng)險(xiǎn)增加，而1歲時(shí)呼吸

3、道有肺炎鏈球菌定植或感染者，以后發(fā)生持續(xù)喘息、急性重癥喘息和因哮喘住院的風(fēng)險(xiǎn)不會(huì)增加，提示不同年齡時(shí)期肺炎鏈球菌感染對(duì)以后哮喘形成影響不同。本研究旨在探討新生期、成年期肺炎鏈球菌感染對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘發(fā)生的影響及其發(fā)生機(jī)制，為哮喘防治提供新的干預(yù)思路。
　　第一部分:新生期BALB/c小鼠非致死性肺炎鏈球菌感染模型建立方法探討
　　肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumonia，S.P）主要定植于上呼吸道，可在鼻咽部黏

4、膜存活數(shù)周，是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染最常見細(xì)菌病原體。建立感染模型是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，目前建立成年小鼠肺炎鏈球菌感染模型方法已經(jīng)成熟，但是如何建立新生期小鼠非致死性肺炎鏈球菌感染模型的方法尚未見報(bào)道。因此本研究探討建立新生期BALB/c小鼠非致死性肺炎鏈球菌感染模型的方法，為后期研究奠定模型基礎(chǔ)。
　　目的:探討建立新生期非致死性肺炎鏈球菌感染BALB/c小鼠的方法。
　　方法:清潔級(jí)新生期BALB/c小鼠80只，隨機(jī)分為肺

5、炎鏈球菌感染1次組、感染2次組和對(duì)照組1、2，每組20只。感染1次組于新生期第7天分別經(jīng)鼻腔滴注D39肺炎鏈球菌107CFU、108CFU、109CFU、1010CFU液各10μl;感染2次組于新生期第6、7天連續(xù)2天經(jīng)鼻腔滴注D39肺炎鏈球菌107CFU、108CFU、109CFU、1010CFU液各10μl;對(duì)照組1、2于第7天和第6、7天分別經(jīng)鼻腔滴注PBS液10μ l。最后一次鼻腔滴注后24小時(shí)隨機(jī)抽取10只小鼠處死，取肺組織勻

6、漿行細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定，HE染色觀察肺組織病理改變。剩余10只連續(xù)觀察5天。
　　結(jié)果:感染2次109CFU肺炎鏈球菌組小鼠出現(xiàn)安靜少動(dòng)，皮膚蒼白，體重增長下降;其感染率與存活率均＞85％;小鼠肺組織細(xì)菌培養(yǎng)鑒定為肺炎鏈球菌;病理顯示肺部出現(xiàn)炎癥改變，肺泡間隔有增厚，血管和支氣管周圍有一定程度炎癥細(xì)胞浸潤。
　　結(jié)論:新生期第6、7天鼻腔滴注109CFU肺炎鏈球菌是成功建立新生期BALB/c小鼠非致死性肺炎鏈球菌感染模型的較好方

7、法。
　　第二部分、新生期肺炎鏈球菌感染對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘的影響及作用機(jī)制研究
　　支氣管哮喘是兒童最常見慢性氣道炎癥性疾病，其發(fā)病原因尚不清楚。盡管病毒感染與哮喘密切相關(guān)，但不能解釋所有哮喘過程。哮喘在兒童時(shí)期最常見，多數(shù)成人哮喘也在嬰幼兒時(shí)期起病，提示生命早期歷程在哮喘發(fā)病中有重要影響，哮喘炎癥病理提示生命早期特定病原菌感染或特定病原抗原暴露減少可能在哮喘發(fā)生發(fā)展中有重要作用。孕期母親患慢性絨毛膜羊膜炎，孩子7歲前反復(fù)喘息及患

8、哮喘風(fēng)險(xiǎn)增高;分娩時(shí)母親子宮有鏈球菌、厭氧菌感染，后代17歲時(shí)哮喘風(fēng)險(xiǎn)顯著增加;提示生命早期特定細(xì)菌感染與以后哮喘發(fā)生相關(guān)。
　　肺炎鏈球菌是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染最常見細(xì)菌病原體，也是哮喘患者呼吸道常見分離菌。哮喘患者鼻咽部肺炎鏈球菌攜帶率率顯著高于非哮喘患者;哮喘患者接種肺炎鏈球菌疫苗后哮喘發(fā)作的次數(shù)減少、哮喘嚴(yán)重程度減輕以及因哮喘發(fā)作住院次數(shù)減少;肺炎鏈球菌肺炎致哮喘癥狀加重，上述研究提示肺炎鏈球菌感染與哮喘發(fā)生密切相關(guān)。

9、也有研究認(rèn)為哮喘急性發(fā)作為病毒感染誘發(fā)，肺炎鏈球菌感染在其中無重要作用，但上述研究都是針對(duì)已經(jīng)患有哮喘的患者進(jìn)行的，而關(guān)于未致敏的健康個(gè)體感染肺炎鏈球菌對(duì)以后發(fā)生哮喘的影響如何研究甚少。Bisgaard等發(fā)現(xiàn)健康新生兒呼吸道有肺炎鏈球菌攜帶或感染，以后發(fā)生持續(xù)喘息、急性重癥喘息和因哮喘住院的風(fēng)險(xiǎn)增加，而1歲時(shí)呼吸道有肺炎鏈球菌定植或感染者，以后發(fā)生持續(xù)喘息、急性重癥喘息和因哮喘住院的風(fēng)險(xiǎn)不會(huì)增加，提示新生期肺炎鏈球菌感染可能同以后哮喘發(fā)

10、生有關(guān)，本研究旨在探討新生期肺炎鏈球菌感染對(duì)成年后實(shí)驗(yàn)性哮喘的影響及其發(fā)生機(jī)制。
　　目的:新生期肺炎鏈球菌感染對(duì)成年后實(shí)驗(yàn)性哮喘的影響及其發(fā)生機(jī)制。
　　方法:清潔級(jí)新生期BALB/c小鼠80只，隨機(jī)分為4組，分別為肺炎鏈球菌感染哮喘組(NeoS.p+OVA)、感染組(NeoS.p)、哮喘組(OVA)和對(duì)照組（Control）。NeoS.p+OVA組及NeoS.p組在小鼠生后第6、7天通過鼻腔滴注肺炎鏈球菌，NeoS.p+

11、OVA組和OVA組用OVA（卵清蛋白）致敏與激發(fā)。小鼠肺功能儀測定小鼠氣道高反應(yīng)性;HE染色觀察小鼠氣道及肺組織病理變化;光學(xué)顯微鏡觀察小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)分類;ELISA檢測BALF中INF-γ、IL-4、IL-5、IL-17、TGF-β及IL-10;流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+Th細(xì)胞各亞群表達(dá)情況。
　　結(jié)果:NeoS.p+OVA組小鼠哮喘癥狀較OVA組明顯;氣道高反應(yīng)性顯著高于OVA組小鼠。NeoS.p+OVA組和OVA

12、組小鼠肺組織、血管周圍和支氣管周圍炎癥較對(duì)照組明顯，且NeoS.p+OVA組氣道炎癥較OVA組明顯加重。NeoS.p+OVA組BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞較OVA組明顯增加，NeoS.p+OVA組BALF中IL-17顯著高于OVA組， IFN-γ顯著低于OVA組，NeoS.p+OVA組肺組織CD4+IL-17+T細(xì)胞顯著高于OVA組。
　　結(jié)論:新生期BALB/c小鼠肺炎鏈球菌感染能促進(jìn)CD4+IL-17+T/IL

13、-17產(chǎn)生促進(jìn)成年后實(shí)驗(yàn)性哮喘發(fā)生。
　　第三部分、成年期肺炎鏈球菌感染對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘的影響及作用機(jī)制研究
　　肺炎鏈球菌是哮喘患者呼吸道常見分離菌，哮喘患者鼻咽部的肺炎鏈球菌攜帶率顯著高于非哮喘患者;肺炎鏈球菌肺炎致哮喘癥狀加重。哮喘患者接種肺炎鏈球菌疫苗后哮喘發(fā)作的次數(shù)減少、哮喘嚴(yán)重程度減輕以及因哮喘發(fā)作住院次數(shù)減少，提示肺炎鏈球菌感染與哮喘密切相關(guān)。Bisgaard等發(fā)現(xiàn)健康新生兒呼吸道有肺炎鏈球菌攜帶或感染，以后發(fā)生持

14、續(xù)喘息、急性重癥喘息和因哮喘住院的風(fēng)險(xiǎn)增加，而1歲時(shí)呼吸道有肺炎鏈球菌定植或感染者，以后發(fā)生持續(xù)喘息、急性重癥喘息和因哮喘住院的風(fēng)險(xiǎn)不會(huì)增加，提示不同年齡時(shí)期肺炎鏈球菌感染對(duì)以后哮喘發(fā)生影響不同。有研究發(fā)現(xiàn)生命早期肺炎鏈球菌感染促進(jìn)成年后哮喘發(fā)生，我們前期研究發(fā)現(xiàn)新生期肺炎鏈球菌感染能通過CD4+IL17+T/IL-17途徑促進(jìn)成年后實(shí)驗(yàn)性哮喘發(fā)生，但成年期肺炎鏈球菌感染對(duì)哮喘形成的影響如何尚不清楚。因此本研究探討成年期肺炎鏈球菌感染對(duì)

15、實(shí)驗(yàn)性哮喘的影響及作用機(jī)制，明確不同年齡肺炎鏈球菌感染對(duì)實(shí)驗(yàn)性形成的影響及機(jī)制。
　　目的:研究成年期感染肺炎鏈球菌對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘影響及其發(fā)生機(jī)制。
　　方法:清潔級(jí)4周BALB/c小鼠80只，隨機(jī)分為4組，分別為肺炎鏈球菌感染哮喘組(AdS.p+OVA)、感染組(AdS.p)、哮喘組(OVA)和對(duì)照組（Control）。AdS.p+OVA組和AdS.p組在小鼠生后第4周通過鼻腔滴注肺炎鏈球菌，AdS.p+OVA組和OVA組給

16、予OVA（卵清蛋白）致敏與激發(fā)。小鼠肺功能儀測定小鼠氣道高反應(yīng)性;HE染色觀察小鼠氣道及肺組織病理變化;光學(xué)顯微鏡觀察小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)分類;ELISA檢測BALF中INF-γ、IL-4、IL-17及IL-10細(xì)胞因子水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+Th細(xì)胞各亞群表達(dá)情況。
　　結(jié)果:AdS.p+OVA組小鼠氣道高反應(yīng)顯著低于OVA組小鼠，支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞明顯低于OVA組，肺組織CD4+CD25Toxp