一種肺炎鏈球菌體磷壁酸合成相關蛋白SPD1672功能研究.pdf

1、背景：本課題組前期工作從肺炎鏈球菌中篩選到一些體內誘導基因,這些體內誘導基因可能與細菌感染致病有關。Spd1672基因是其中的一個體內誘導基因,經過生物信息學分析,其表達產物SPD1672蛋白含有脂質A核心-O抗原連接酶結構域,提示該基因可能與細菌細胞壁多糖形成相關,本課題擬對spd1672基因功能進行鑒定,探尋它影響細胞壁多糖合成的生物學證據(jù),并進一步研究其在感染致病過程中的毒力機制。
　　 方法：首先通過基因替代失活法構建肺

2、炎鏈球菌spd1672基因缺陷菌(D39△1672);通過透射電子顯微鏡對細菌莢膜厚度進行觀察;通過C反應蛋白結合實驗及補體C3沉積實驗觀察細菌磷壁酸合成量改變,并進一步對細胞壁原生質及細胞壁壁進行分離,通過western blot確證野生菌與缺陷菌壁磷壁酸(WTA)及脂磷壁酸(LTA)合成量變化情況。通過增加Mg2+濃度改變培養(yǎng)基滲透壓,觀察野生菌與缺陷菌對高滲環(huán)境的耐受能力。用小鼠毒力實驗比較spd1672缺陷菌與野生菌的毒力改變:

3、并通過體內定植實驗、殺菌實驗、細胞因子測定等研究方法,對spd1672影響肺炎鏈球菌毒力的機制進行初步探討。
　　 結果：D39△1672較D39在體外培養(yǎng)條件下生長能力減弱,通過透視電子顯微鏡觀察,D39△1672與D39莢膜厚度并無明顯改變。C反應蛋白結合實驗結果顯示D39△1672結合CRP量較D39明顯減少。而補體C3沉積實驗結果顯示D39△1672結合補體C3量較D39明顯減少。進一步利用抗磷壁酸抗體對兩種細菌磷壁酸合

4、成量進行western blot分析后發(fā)現(xiàn),D39△1672較D39菌WTA和LTA合成量菌明顯減少。改變生長培養(yǎng)基的離子濃度后發(fā)現(xiàn),在加入50mM Mg2+條件下,D39△1672的增殖速率較正常培養(yǎng)基中明顯提高(P＜0.05),而對D39并無明顯影響,而在100mM、200mM Mg2+條件下,D39△1672的增殖受到顯著抑制(P＜0.05),而D39僅受輕微影響(P＞0.05)。通過腹腔途徑感染小鼠,結果顯示D39△1672毒力

5、較D39菌明顯減弱,其感染小鼠后入血菌量較D39明顯減少(P＜0.05),在鼻咽部、肺部定植數(shù)也較D39顯著減少(P＜0.05)。全血殺菌實驗結果顯示D39△1672對白細胞的殺菌作用抵抗力較D39顯著減弱(P＜0.05)。通過對細胞因子測定,結果發(fā)現(xiàn)D39感染的小鼠較D39△1672誘導更高水平的IL12、TNF-α。
　　 結論：通過本研究顯示spd1672基因是影響磷壁酸合成的關鍵基因,該基因缺失后,會引起細菌磷壁酸合成顯