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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:A族鏈球菌(groupA streptococcus,GAS)是一種常見的革蘭氏陽性菌,可以引起多種侵襲性感染和自身免疫性疾病。在大多數(shù)發(fā)展中國家GAS感染導(dǎo)致的風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性心臟病、腎小球腎炎等仍然是嚴(yán)重威脅人們生活質(zhì)量的一大問題。而對(duì)于GAS感染的治療目前大多為青霉素、大環(huán)內(nèi)酯類藥物或靜脈注射免疫球蛋白,但由于耐藥性或保護(hù)作用短暫等原因致使GAS感染仍舊保持著很高的復(fù)發(fā)率。所以制備成功有效的GAS疫苗成為GAS預(yù)防和治療的研究
2、熱點(diǎn)。
本室前期已構(gòu)建了包含7個(gè)FbaA表位和M蛋白1、3、6、18血清型的與人無交叉反應(yīng)的部分基因及M蛋白的C端共同基序(J基因)的pET28a/F7M5[1],但是根據(jù)近期新的流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國大部分地區(qū)GAS流行菌株中M12血清型占了一大部分。故本實(shí)驗(yàn)在本室構(gòu)建好的質(zhì)粒的外源基因序列上插入M12與人無交叉反應(yīng)的基因片段并表達(dá),該蛋白命名為F7M6,又以其為模板構(gòu)建表達(dá)了只含有6個(gè)不同M蛋白血清型的基因片段,該蛋白命名
3、為M6。將F7M6蛋白,M6蛋白和本室保存的M1全長(zhǎng)蛋白(簡(jiǎn)稱M蛋白)分別免疫小鼠,通過ELISPOT、ELISA等實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察細(xì)胞免疫和體液免疫效果,并攻毒后計(jì)算存活率,以確定疫苗保護(hù)效果。
方法:
1利用生物信息學(xué)方法在美國疾病預(yù)防和控制中心(CDC)數(shù)據(jù)庫獲GAS M12血清型的基因序列,通過與人體組織基因比對(duì)選取與人無交叉反應(yīng)的特異性序列,采用搭橋PCR的方法擴(kuò)增并插入F7M5序列中,得到F7M6序列。
4、> 2在線預(yù)測(cè)F7M6序列表位。
3在線預(yù)測(cè)F7M6蛋白空間結(jié)構(gòu)和親水性分析。
4以F7M6序列為模板,PCR擴(kuò)增出含有M蛋白1、3、6、18、12血清型和M蛋白C端共同基序(J基因)的基因序列,得到M6序列。
5將兩段基因片段克隆至載體pET28a中,測(cè)序正確后將陽性質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳觀察結(jié)果,Western blot鑒定。采用親和層析純化方法對(duì)兩種
5、蛋白進(jìn)行純化。
6將純化的兩種蛋白,連同本室保存的GAS M蛋白,以相同劑量聯(lián)合佐劑分別免疫小鼠,腹部皮下多點(diǎn)注射,同時(shí)設(shè)立PBS對(duì)照組。每組12只,20μg/每只;免疫間隔21天,共免疫4次;于每次免疫10天后下頜竇靜脈取血,分離血清,-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 7末次免疫后10天,處死6只小鼠,ELISPOT檢測(cè)小鼠脾臟免疫細(xì)胞表達(dá)IL-4和IFN-γ的水平,ELISA檢測(cè)各組血清中IgG、IgG1、IgG2a的水平及動(dòng)
6、態(tài)變化。
8用ELISA法檢測(cè)臨床獲取的抗鏈“O”陽性和健康兒童血清與F7M6蛋白的特異性結(jié)合能力。
9采用全菌ELIAS法,檢測(cè)臨床獲取的GAS菌株與F7M6組血清的結(jié)合能力。
10用致死量的M1GAS腹腔攻擊各組剩余下的6只小鼠,觀察并計(jì)算各組存活率。
結(jié)果:
1成功構(gòu)建了pET28a/F7M6、pET28a/M6陽性質(zhì)粒,并成功表達(dá)蛋白。Western blot結(jié)果顯示兩種蛋白均可
7、以與F7M5抗體雜交。
2 ELISA檢測(cè)各組血清,結(jié)果顯示,隨免疫次數(shù)增加,IgG水平逐漸增高,F(xiàn)7M6組效價(jià)達(dá)到1∶669309,M6組效價(jià)達(dá)到1∶58158,M蛋白組達(dá)到1∶32980,。F7M6組顯著高于M6組和M蛋白組(P<0.001),但M6組和M蛋白組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
3血清IgG1和IgG2a檢測(cè)結(jié)果顯示,三組均可誘導(dǎo)較高水平的相應(yīng)抗體,均顯著高于PBS組(P<0.001),IgG1各組間沒有顯著差異
8、,IgG2a水平則F7M6組顯著高于M6組(P=0.009),但F7M6組與M蛋白組、M6與M蛋白組間沒有差異。
4 ELISPOT結(jié)果顯示,IL-4,IFN-γ水平:F7M6、M6和M蛋白組均顯著高于PBS組(P<0.001),且F7M6組的水平最高,而M蛋白組高于M6組(P<0.05)。
5用F7M6蛋白作為診斷抗原檢測(cè)抗鏈“O”陽性的病人血清及健康人血清,結(jié)果顯示,抗鏈“O”陽性的病人血清,陽性檢出率為(95%
9、),而健康兒童血清的陽性率為(47.3%),二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)。
6 ELISA檢測(cè)4株臨床株于不同組的血清的結(jié)合能力,結(jié)果顯示F7M6均能與其結(jié)合。
7攻毒后,F(xiàn)7M6、M6和M蛋白各組生存率分別為66.7%、33.3%和66.7%,PBS組全部死亡。統(tǒng)計(jì)分析顯示各實(shí)驗(yàn)組均高于PBS組(P<0.05)。
結(jié)論:
1成功構(gòu)建并表達(dá)F7M6和M6蛋白。
2 F7M6、
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