肺炎鏈球菌非經(jīng)典分泌蛋白GAPDH的分泌機(jī)制及其與熱休克蛋白DnaJ的相互作用研究.pdf

1、目的：明確肺炎鏈球菌非經(jīng)典分泌蛋白GAPDH的分泌是否由細(xì)菌裂解引起，并確定 GAPDH分泌必需結(jié)構(gòu)域。同時，驗證該蛋白與熱休克蛋白的DnaJ的相互作用，為深入研究GAPDH的分泌機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：原核表達(dá)GAPDH重組蛋白并制備其多克隆抗體，利用該多克隆抗體通過Western Blot評價GAPDH在肺炎鏈球菌中的保守性。缺失肺炎鏈球菌主要自溶酶 LytA使其喪失自溶能力，通過 Western Blot比較野生菌和Lyt

2、A缺陷菌GAPDH的分泌是否存在差異。同時以只在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的CodY蛋白為參照，鑒定肺炎鏈球菌對數(shù)生長早期GAPDH的分泌是否伴有細(xì)菌裂解。利用Jpred3軟件分析GAPDH二級結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域，利用Swiss-Model軟件對GAPDH進(jìn)行同源模建，根據(jù)生物信息學(xué)結(jié)果進(jìn)行截短表達(dá)設(shè)計。利用分子克隆技術(shù)將不同GAPDH截短表達(dá)基因片段克隆到異位表達(dá)載體pJW-v25質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化肺炎鏈球菌D39，采用0.15mm Zn

3、2+誘導(dǎo)表達(dá)含有GFP標(biāo)簽的GAPDH。分離亞組份，采用Western Blot檢測截短表達(dá)的GAPDH在肺炎鏈球菌的定位，初步確定分泌必需結(jié)構(gòu)域。采用結(jié)構(gòu)替代和氨基酸突變兩種方法進(jìn)一步驗證分泌必需結(jié)構(gòu)域在GAPDH分泌中的作用，并確定參與GAPDH分泌的關(guān)鍵性氨基酸。將肺炎鏈球菌 GAPDH分泌必需結(jié)構(gòu)域和枯草芽孢桿菌168菌株的GAPDH同源序列進(jìn)行替換，評價該分泌必需結(jié)構(gòu)域是否具有普遍性。在肺炎鏈球菌中，將GAPDH的結(jié)構(gòu)域I進(jìn)行

4、直接連接或柔性結(jié)構(gòu)連接后，與GFP標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)，觀察融合蛋白的分泌及表面定位情況，以確定結(jié)構(gòu)域I能否作為一個信號肽介導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌。在肺炎鏈球菌中異位表達(dá)枯草芽孢桿菌168菌株 GAPDH，觀察其分泌情況，探討GAPDH在肺炎鏈球菌和枯草芽孢桿菌中是否具有共同的分泌途徑。采用大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)、直接結(jié)合實驗、生物膜干涉技術(shù)驗證GAPDH和熱休克蛋白DnaJ的相互作用，并初步探討DnaJ對GADPH分泌的影響。
　　結(jié)果：獲得了

5、純度達(dá)90％的GAPDH重組蛋白，并制備了效價達(dá)107的抗GAPDH多克隆抗體。Western blot結(jié)果顯示，在對數(shù)生長早期二型肺炎鏈球菌莢膜型D39和莢膜缺陷型R6細(xì)胞壁及培養(yǎng)上清中均檢測到GAPDH的表達(dá)，但是并沒有檢測到CodY的表達(dá)。同時，主要自溶酶 LytA缺失后，培養(yǎng)上清依舊檢測到 GAPDH的表達(dá)，與野生菌相比無明顯差異。提示，肺炎鏈球菌GAPDH的分泌不是由于細(xì)菌自溶引起。用Jpred3軟件分析發(fā)現(xiàn)，GAPDH具有兩

6、個結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域I和II。結(jié)構(gòu)域I由N末端的1-150aa和C末端α螺旋（317-335aa）構(gòu)成。結(jié)構(gòu)域II由151-316aa構(gòu)成。對GAPDH進(jìn)行同源建模，也發(fā)現(xiàn)GAPDH N末端和C末端在空間上相互靠近構(gòu)成結(jié)構(gòu)域I。根據(jù)以上生物信息學(xué)結(jié)果我們設(shè)計了GAPDH截短表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，結(jié)構(gòu)域I的 N末端1-30aa和（或） C末端α螺旋缺失后， GAPDH都不能定位于細(xì)菌表面及分泌到培養(yǎng)上清，提示結(jié)構(gòu)域 I是GA

7、PDH在細(xì)胞表面定為及分泌的必需結(jié)構(gòu)域。氨基酸突變結(jié)果顯示， N末端的氨基酸3VKVGIN9、18GGG20和C末端325RTLEYF330突變后GAPDH的表面定位和胞外分泌都缺失，提示這些氨基酸是 GAPDH的表面定位和分泌的關(guān)鍵氨基酸。此外10F突變后，GAPDH在上清中消失，但仍出現(xiàn)于細(xì)胞表面，提示該突變只影響了GAPDH在上清的分泌，并不影響 GAPDH在細(xì)胞表面的定位；而322QLV324突變后， GAPDH不能定位到細(xì)胞表

8、面，但是可以分泌到培養(yǎng)上清，提示該突變只影響了GAPDH在細(xì)胞表面的定位，并不影響GAPDH在上清的分泌。單獨(dú)的結(jié)構(gòu)域I與GFP融合后，其只表達(dá)于胞內(nèi)，上清中沒有檢測到融合蛋白，柔性結(jié)構(gòu)連接的結(jié)構(gòu)域I也不能分泌到胞外，提示單獨(dú)的結(jié)構(gòu)域 I不能介導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌?？莶菅挎邨U菌168菌株GAPDH在肺炎鏈球菌中能夠表達(dá)，但在細(xì)胞表面和上清中均檢測不到該蛋白，提示其在肺炎鏈球菌中不能定位到細(xì)胞表面及分泌到胞外，表明GAPDH在枯草芽孢桿菌和肺炎

9、鏈球菌中的分泌途徑存在差異。大腸桿菌雙雜交、ELISA直接結(jié)合實驗和BLI生物膜干涉技術(shù)結(jié)果顯示GAPDH和熱休克蛋白DnaJ具有直接的相互作用。
　　結(jié)論：肺炎鏈球菌GAPDH的分泌并不是細(xì)菌自身裂解引起的，結(jié)構(gòu)域I的是其表面定位及分泌所必需的，但不足以使蛋白分泌到胞外。N末端氨基酸3VKVGIN9、18GGG20和C末端325RTLEYF330是GAPDH的表面定位和分泌的關(guān)鍵氨基酸。肺炎鏈球菌和枯草芽孢桿菌中的GAPDH分泌