豬鏈球菌2型與豬中性粒細(xì)胞相互作用研究.pdf

1、豬鏈球菌2型(Strreptococcus suis serotype2，SS2)是一種人畜共患傳染病病原，對于養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展以及人類的生命健康具有嚴(yán)重威脅。近年來，豬鏈球菌2型的危害引起國內(nèi)外的廣泛關(guān)注，其分子致病機理和免疫方面的研究是目前研究的熱點。盡管很多學(xué)者從單個或多個毒力因子的角度去闡述豬鏈球菌2型的分子致病機理，取得了一些進展，但仍無法很好的解釋其如何突破機體的天然免疫系統(tǒng)以及血腦屏障，從而引起腦膜炎等病癥。
　　

2、 病原菌致病通常不是由單一毒力因子引起，而是由多種毒力因子的共同作用而造成的，毒力因子在調(diào)控系統(tǒng)的控制下，形成一個精致的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。雙組份調(diào)控系統(tǒng)(Two-Component Regulatory System，TCS)是細(xì)菌中廣泛存在的一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，能將外界環(huán)境中感應(yīng)到的信息傳給內(nèi)部系統(tǒng)。研究證實，TCS參與調(diào)控細(xì)菌毒力因子表達(dá)、細(xì)菌致病性和生長代謝等，目前在SS2中發(fā)現(xiàn)有至少15對雙組分調(diào)控系統(tǒng)。中性粒細(xì)胞(Polymorp

3、honuclear leukocytes，PMNs or Neutrophils)存在血液中，是體內(nèi)數(shù)量最多的白細(xì)胞，類似巨噬細(xì)胞，具有吞菌活性，在急性炎癥中起著十分重要的作用，是機體抵抗病原菌的第一道防線。
　　 病原與宿主的相互作用在其致病過程中扮演重要作用。盡管多種SS2毒力因子已被證實在致病中具有重要作用，但細(xì)菌與天然免疫系統(tǒng)作用后基因表達(dá)變化的全面分析報道卻很少。而且，對豬鏈球菌2型引起急性炎癥或逃避宿主天然免疫的分子

4、機制了解非常有限。本文選取SS2野生株SC19和豬中性粒細(xì)胞(PMNs)為研究對象，將SS2與PMNs相互作用后，通過基因表達(dá)譜芯片、生物信息學(xué)分析、熒光定量PCR等方法獲得差異表達(dá)基因并分類；以CD1小鼠為模型評價雙組份調(diào)控系統(tǒng)基因1660HK/RR，1910HK/RR和1094HK/RR基因缺失突變株△1660HK/RR，△1910HK/RR、△1094HK/RR的毒力以及引起的炎癥反應(yīng)，為闡明雙組份調(diào)控系統(tǒng)引起急性炎癥反應(yīng)或免疫逃

5、避的分子機制，深入研究S.suis2分子致病機理奠定理論基礎(chǔ)，也為S.suis2新型疫苗和藥物靶標(biāo)分子設(shè)計提供新的思路。具體研究內(nèi)容如下：
　　 1.豬中性粒細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
　　 本研究采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PMNs，經(jīng)Giemsa染色后檢測PMNs的純度為98%，采用苔盼藍(lán)(0.01%濃度)排除法檢測PMNs活力為96%，符合實驗要求。
　　 2.豬鏈球菌2型感染豬中性粒細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄

6、表達(dá)譜結(jié)果與分析
　　 將SS2與PMNs互作，并在0.5h、1h、和3h時間點采集樣品制備表達(dá)譜芯片，與無中性粒細(xì)胞對照組的雜交后的表達(dá)譜芯片的信號值相比較，F(xiàn)old Change(FC)≥2的轉(zhuǎn)錄本為上調(diào)，F(xiàn)C≤0.5的為下調(diào)，F(xiàn)C在0.5到2之間為無顯著變化。結(jié)果表明，0.5h時有154個基因上調(diào)表達(dá)，188個基因下調(diào)表達(dá)；1h時有213個基因上調(diào)表達(dá)，223個基因下調(diào)表達(dá)；3h時有531個基因上調(diào)表達(dá)，665個基因下調(diào)表

7、達(dá)。3個時間點都上調(diào)的基因有75個，都下調(diào)的基因有81個。
　　 進一步對差異表達(dá)的TCS基因分析發(fā)現(xiàn)，SSU05_0427、SSU05_0906、SSU05_0944、SSU05_1358、SSU05_1595、SSU05_1660和SSU05_1685等7個基因一直上調(diào)表達(dá)；而SSU05_0883、SSU05_2090，2個基因一直下調(diào)表達(dá)；SSU05_0430、SSU05_1910和SSU05_2148，3個基因先下調(diào)表達(dá)

8、后上調(diào)表達(dá)；SSU05_1094基因先上調(diào)表達(dá)，然后下調(diào)表達(dá)。
　　 3.TCS基因缺失突變株對致病性和炎癥反應(yīng)的影響
　　 在SS2與天然免疫細(xì)胞豬中性粒細(xì)胞的相互作用過程中，雙組份調(diào)控系統(tǒng)基因呈現(xiàn)不同的表達(dá)情況，且在不同時間發(fā)揮作用。1094HK/RR、1660HK/RR和1910HK/RR基因分別在免疫反應(yīng)的早期、中期和后期發(fā)揮作用。
　　 以CD-1小鼠為模型，動物實驗結(jié)果表明，雙組份調(diào)控系統(tǒng)基因1910