2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype2,SS2)是近年來新發(fā)的一種重要的人獸共患病病原體,人經(jīng)傷口感染豬鏈球菌后主要引起腦膜炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥和鏈球菌中毒性休克綜合征(STSS)等癥狀。目前,對于豬鏈球菌2型致病機(jī)制,尤其是豬鏈球菌2型在人血中如何逃逸補(bǔ)體介導(dǎo)的吞噬殺傷研究還不是很清楚。
  補(bǔ)體作為天然免疫防御中的一個重要成分,是保護(hù)宿主免受外來病原體入侵的一個有力武器。補(bǔ)體激活是一種高度有序的

2、級聯(lián)反應(yīng),宿主體內(nèi)補(bǔ)體激活有三條途徑:經(jīng)典途徑;甘露糖結(jié)合凝集素途徑;替代途徑。這三條途徑都形成C3轉(zhuǎn)化酶,裂解C3產(chǎn)生活性補(bǔ)體成分C3b,大量的C3b分子與病原體結(jié)合是補(bǔ)體活化中的重要事件。大部分能夠引起侵襲性疾病的病原菌都得益于通過直接抑制C3b或招募H因子(human Factor H,hFH)來抑制其表面C3b的沉積和功能,進(jìn)而抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的活化和補(bǔ)體受體介導(dǎo)的吞噬。
  實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌2型毒力因子表面蛋白Fh

3、b(factor H-binding protein),能夠招募人血清中的補(bǔ)體負(fù)調(diào)節(jié)子hFH,抑制補(bǔ)體替代途徑的活化,從而增強(qiáng)豬鏈球菌在血中存活及抗吞噬的能力;并通過GST-pulldown技術(shù)篩選到Fhb除了結(jié)合hFH外,還能與補(bǔ)體蛋白C3b、C3d相互作用,但是他們之間相互作用的具體分子機(jī)制卻不是很清楚,Fhb與C3b的結(jié)合對宿主補(bǔ)體系統(tǒng)的影響有何作用也值得進(jìn)一步研究。
  本研究第一部分主要是驗(yàn)證Fhb蛋白功能結(jié)構(gòu)域Fhb-

4、Ⅲ*與補(bǔ)體蛋白hFH、C3b以及C3d的結(jié)合。通過基因工程重組表達(dá),構(gòu)建了以pET28a為載體的7個Fhb截短結(jié)構(gòu)域蛋白(Fhb-Ⅰ45-344;Fhb-Ⅱ45-170;Fhb-Ⅲ171-344;Fhb-Ⅳ345-664;Fhb-Ⅴ345-483;Fhb-Ⅵ484-664;Fhb-Ⅲ*134-344)和4個敲除結(jié)構(gòu)域蛋白△37(△134-170aa);△3(△171-344aa);△3N(△171-232aa);△3C(△233-344

5、aa),利用鎳親和層析純化獲得目的蛋白。采用ELISA,配體印跡和生物膜干涉(Biolayer Interferometry,BLI)的技術(shù)來驗(yàn)證Fhb結(jié)合補(bǔ)體系統(tǒng)組分蛋白hFH、C3b、C3d,并確定了結(jié)合區(qū)域主要位于Fhb-Ⅲ*(134-344aa)。另外,通過生物膜干涉技術(shù)分析得出Fhb-Ⅲ*與hFH、C3b、C3d之間的親和力常數(shù)KD值分別為83.51nM,17.09nM,141.5nM.本部分還對hFH與Fhb-Ⅲ*的結(jié)合方式

6、進(jìn)行了探索,結(jié)果顯示,隨著溶液中氯化鈉和乙二醇濃度的增加,hFH與Fhb-Ⅲ*的結(jié)合能力減弱,揭示hFH與Fhb-Ⅲ*之間的結(jié)合方式部分依賴于離子鍵的作用,更多的是疏水作用和靜電作用的聯(lián)合。
  本研究第二部分內(nèi)容為Fhb-Ⅲ*抑制補(bǔ)體激活機(jī)制的研究。首先利用穿梭質(zhì)粒pAT18構(gòu)建了將功能結(jié)構(gòu)域Fhb-Ⅲ171-344敲除的缺失互補(bǔ)株CΔSsfhb-3,采用免疫熒光-激光掃描共聚焦顯微鏡觀察和免疫印跡的方法對Fhb蛋白進(jìn)行定位,發(fā)

7、現(xiàn)Fhb不僅表達(dá)于豬鏈球菌2型的表面,在培養(yǎng)的上清中也可檢測到。然后,采用流式細(xì)胞術(shù)(fluorescence activated cell sorter,FACS)構(gòu)建的人血清-豬鏈球菌相互作用模型,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清中的Fhb蛋白能夠明顯抑制突變株ΔSsfhb表面補(bǔ)體C3b/iC3b的沉積,加入重組表達(dá)的結(jié)構(gòu)域蛋白驗(yàn)證得到Fhb主要依賴于其功能結(jié)構(gòu)域Fhb-Ⅲ*發(fā)揮作用。
  綜上所述,本研究結(jié)果證實(shí)了Fhb通過其功能結(jié)構(gòu)域Fhb-

8、Ⅲ*直接結(jié)合補(bǔ)體系統(tǒng)組分蛋白hFH、C3b、C3d,并能夠在培養(yǎng)上清中以分泌蛋白的形式發(fā)揮作用;表明Fhb蛋白的雙功能性,即(1)表達(dá)于菌體表面的Fhb蛋白通過結(jié)合血漿補(bǔ)體負(fù)調(diào)節(jié)子hFH,與C3b/C3d分子形成復(fù)合物,進(jìn)而降解C3b分子,抑制補(bǔ)體激活替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶的形成,從而逃避補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷作用。(2)菌體表面的Fhb蛋白在某種作用力的剪切下脫落到培養(yǎng)的上清中,暴露出活性區(qū)域Fhb-Ⅲ*,并通過這一活性區(qū)域直接結(jié)合血清中的C3b

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