2型豬鏈球菌表面蛋白Hp0272參與逃逸宿主天然免疫的分子機(jī)制研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis)屬于蘭氏(Lancefield)分類法的R群，能夠感染人和豬，是重要的新發(fā)傳染病病原體。35個(gè)血清型中以2型(Streptococcus suis serotype 2，SS2)流行最廣，致病性最強(qiáng)。SS2表面假說蛋白0272(hypothetical protein 0272，Hp0272)，作為粘附配體分子還具有強(qiáng)免疫原性，可作為候選的疫苗分子，該蛋白具有增強(qiáng)豬鏈球菌逃逸宿主天然免疫及

2、抗吞噬殺傷的功能，但其分子機(jī)制還不清楚。
　　 本研究建立了豬鏈球菌-人血清相互作用模型，利用流式細(xì)胞術(shù)(fluorescence activted cell sorter，F(xiàn)ACS)分析確定了豬鏈球菌激活補(bǔ)體的途徑，通過比較SS2強(qiáng)毒力株05ZYH33，突變株△0272和互補(bǔ)株C△0272表面補(bǔ)體的沉積，確定Hp0272在豬鏈球菌抑制替代補(bǔ)體途徑激活中的作用，驗(yàn)證了Hp0272與人替代補(bǔ)體途徑的負(fù)調(diào)節(jié)子H因子(human Fa

3、ctor H，hFH)的相互作用以及該相互作用對抑制人血清補(bǔ)體激活的影響；重組純化了GST(glutathione S-transferase)標(biāo)簽Hp0272融合蛋白，通過GST-Pulldown技術(shù)初步研究了Hp0272與hFH的結(jié)合方式及其與其他血漿蛋白的結(jié)合。揭示了Hp0272在豬鏈球菌逃避宿主天然免疫反應(yīng)，抗吞噬殺傷中的功能及分子機(jī)制。具體結(jié)果如下：
　　 1.Hp0272對豬鏈球菌激活人血清補(bǔ)體的影響
　　

4、通過流式細(xì)胞術(shù)分析比較了SS2強(qiáng)毒力株05ZYH33，突變株△0272和互補(bǔ)株C△0272表面補(bǔ)體(C3b/iC3b和iC3b)沉積，發(fā)現(xiàn)血清濃度為50%時(shí)，△0272表面沉積的C3b/iC3b(熒光指數(shù)(fluorescence index，F(xiàn)I)=(10.7±5.0)×107)顯著高于05ZYH33(FI=(3.8±0.2)×107)和C△0272(FI=(4.6±2.1)×107)，而△0272表面結(jié)合的iC3b(FI=(3.5±

5、0.2)×106)顯著低于05ZYH33(FI=(5.7±0.0)×106)和C△0272(FI=(4.2±0.0)×106)。提示Hp0272對豬鏈球菌激活人血清補(bǔ)體的過程中有抑制，△0272表面結(jié)合的iC3b顯著低于05ZYH33和C△0272，提示Hp0272很可能與補(bǔ)體途徑的負(fù)調(diào)節(jié)子有相互作用，將C3b降解為iC3b。
　　 2.豬鏈球菌激活人血清補(bǔ)體的途徑分析
　　 構(gòu)建FACS模型，并從抗體濃度方面優(yōu)化了該模

6、型，采用此模型通過經(jīng)典(classical pathway，CP)，替代(alternative pathway，AP)和凝集素(lectin pathway，LP)途徑抑制劑進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)典途徑和凝途徑的抑制劑均不能起到抑制作用，而替代途徑的抑制劑能抑制90%以上的C3沉積，說明豬鏈球菌主要通過替代途徑激活補(bǔ)體，進(jìn)一步推測Hp0272可能與hFH結(jié)合。
　　 3.Hp0272與hFH相互作用的鑒定
　　 采用配體

7、印跡的方法鑒定到Hp0272與人血清中的hFH的特異性結(jié)合但不結(jié)合純的hFH蛋白，提示Hp0272與hFH的結(jié)合可能是間接結(jié)合。通過FACS進(jìn)行了菌株原位水平的驗(yàn)證，即結(jié)合到△0272表面的hFH(FI=(0.7±0.2)×106)顯著低于05ZYH33(FI=(1.4±0.3)×106)和C△0272(FI=(2.4±0.6)×106)；抗hFH抗體阻封實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)05ZYH33和C△0272 hFH封閉后補(bǔ)體結(jié)合量提高到2-3倍，而△0

8、272無顯著變化，說明Hp0272與hFH的結(jié)合抑制豬鏈球菌表面補(bǔ)體的激活。
　　 4.Hp0272與hFH的結(jié)合方式及Hp0272與其他血漿蛋白配體的鑒定
　　 構(gòu)建立了pGEX-4T-1-0272的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21，表達(dá)并純化GST-Hp0272融合蛋白。采用此蛋白進(jìn)行特異性強(qiáng)的GST-Pulldown，選取兩條差異點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一條為hFH與C3d的復(fù)合