肺炎鏈球菌烯醇化酶與熱休克蛋白DnaJ相互作用研究.pdf

1、目的:
　　明確肺炎鏈球菌糖酵解關鍵酶烯醇化酶(enolase，Eno)與熱休克蛋白DnaJ是否有直接結合及結合位點，初步探討DnaJ蛋白對Eno蛋白胞內(nèi)蛋白水平及胞外分泌的影響。
　　方法:
　　原核表達并純化Eno全長蛋白，鑒定其酶活性，利用重組Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠制備特異性抗血清，分析其蛋白表達及胞外分泌情況；采用生物膜層干涉(biolayer interferometrvy，BLI)技術和直接結合實驗鑒定

2、Eno和DnaJ兩者之間是否存在直接相互作用；在前者結果陽性的基礎上，截短表達Eno蛋白，通過直接結合實驗鑒定Eno蛋白結合DnaJ的位點。根據(jù)結合位點結果，構建一系列異位表達的重組pJWv25-eno截短片段，轉(zhuǎn)化肺炎鏈球菌R6菌株，Western blot檢測各片段的胞內(nèi)及胞外蛋白水平，分析DnaJ的結合對Eno蛋白水平的影響。在肺炎鏈球菌中過表達DnaJ蛋白，通過Western blot檢測Eno蛋白的胞內(nèi)及胞外蛋白水平，進一步鑒

3、定DnaJ對Eno蛋白胞內(nèi)蛋白水平及分泌的影響。
　　結果:
　　成功表達重組 Eno蛋白，純度達90％，該蛋白具有α-Eno酶活性；重組 Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠后，獲得效價達1:7.68×106的特異性抗血清；Western blot分析顯示，7種不同血清型肺炎鏈球菌培養(yǎng)上清中均在分子量約47 kD處出現(xiàn)特異性反應帶；直接結合試驗顯示，隨著Eno蛋白量的增加，Eno與DnaJ的結合量也相應增加(r=0.920，P=0.

4、000),其吸光度值從0.222±0.042(1.25μg)增加到0.569±0.099(20.0μg)；BLI技術測定兩者結合的親和常數(shù)為926 nmol/L；截短的Eno(aa1-aa100)與DnaJ的結合量2.25±0.38高于其他截短序列的結合量0.94±0.25、1.08±0.09、0.75±0.12，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000，P=0.001，P=0.000)。Western blot結果顯示，各截短片段均能在肺炎