肺炎鏈球菌DnaJ調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae,S.pn）是一種革蘭陽(yáng)性的條件致病菌，能夠引起腦膜炎、敗血癥和社區(qū)獲得性肺炎等多種侵襲性疾病。耐藥菌的廣泛出現(xiàn)使得疫苗預(yù)防成為控制S.pn感染的有效策略。肺炎鏈球菌DnaJ是一種與S.pn毒力相關(guān)的熱休克蛋白（heat shock protein，Hsp）,屬于Hsp40家族，作為疫苗經(jīng)鼻腔或腹腔免疫小鼠，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗S.pn感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答，但是

2、其具體免疫應(yīng)答機(jī)制不清。研究DnaJ誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的機(jī)制有助于S.pn疫苗的研發(fā)。
　　樹突狀細(xì)胞（dendritic cell,DC）是已知的最有效的專職抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），在抗病原體的固有免疫和適應(yīng)性免疫中都發(fā)揮重要作用。在其他細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)多種熱休克蛋白可以活化DC[1,2]。最近在S.pn中也發(fā)現(xiàn)，Hsp100/ClpP可以被Toll-樣受體4(Toll-like rese

3、ptor4,TLR4)識(shí)別，通過(guò)活化MAPK和NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)DC活化和成熟，從而啟動(dòng)Th1免疫應(yīng)答[3]。然而，作為一種熱休克蛋白，肺炎鏈球菌DnaJ能否誘導(dǎo)DC的成熟、介導(dǎo)DC成熟的分子機(jī)制，以及對(duì)T細(xì)胞的極化情況還未見報(bào)道。
　　在本研究中，我們旨在研究肺炎鏈球菌DnaJ介導(dǎo)DC成熟的效能及其誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的機(jī)制。
　　方法：
　　1.利用大腸桿菌原核表達(dá)DnaJ重組蛋白(recombinant Dna

4、J,rDnaJ)純化并去除LPS。
　　2.研究rDnaJ蛋白誘導(dǎo)DC活化的機(jī)制
　　(1)rDnaJ蛋白作用于小鼠骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞(bone marrow-derived dendritic cell,BMDC)，流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry,FCM）檢測(cè)BMDC上 MHCII、CD86、CD40的表達(dá)；ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-12p40的分泌情況。
　　(2)rDnaJ蛋白刺

5、激TLR2 KO、TLR4 KO小鼠和WT小鼠來(lái)源的BMDC后，F(xiàn)CM檢測(cè)MHCII、CD86、CD40的表達(dá)；ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的分泌情況。
　　(3)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,

6、PI3K)抑制劑抑制劑預(yù)處理BMDC后，ELISA檢測(cè)rDnaJ其對(duì)TNF-α和IL-6分泌的影響；Western blot檢測(cè)MAPK、NF-κB和Akt的磷酸化水平。
　　3.研究rDnaJ蛋白誘導(dǎo)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答機(jī)制
　　(1)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)rDnaJ蛋白活化的BMDC在促進(jìn)T細(xì)胞分化中的作用。
　　rDnaJ蛋白刺激后的DC與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)36h，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-4和IL-17A的表

7、達(dá)；FCM分別檢測(cè)IFN-γ+CD4+、IL-4+CD4+和IL-17A+CD4+細(xì)胞的百分比。
　　(2)過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)rDnaJ蛋白活化的BMDC在促進(jìn)T細(xì)胞分化中的作用。
　　分別在第0、14和28d,將rDnaJ蛋白刺激后的BMDC經(jīng)腹腔過(guò)繼轉(zhuǎn)移到WT小鼠體內(nèi)。取小鼠脾細(xì)胞，在體外經(jīng)rDnaJ蛋白再次刺激36h后，ELISA檢測(cè)脾細(xì)胞上清中IFN-γ、IL-4和IL-17A水平。
　　(3)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TLR

8、2和TLR4在誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答中的作用
　　將WT、TLR2 KO小鼠和TLR4 KO小鼠各分為3組：CT+rDnaJ蛋白組、CT組和PBS組。在第0、7和14d免疫小鼠后，用rDnaJ蛋白刺激免疫小鼠脾細(xì)胞3d后，ELISA檢測(cè)IFN-γ、IL-4和IL-17A水平。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-dnaJ，誘導(dǎo)表達(dá)后獲得了高純度的rDnaJ蛋白；并且采用PmB-agarose去除蛋白

9、溶液中的LPS，使LPS殘留量不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.成功培養(yǎng)了小鼠BMDC，其純度達(dá)80％以上。
　　3.rDnaJ蛋白能夠誘導(dǎo)小鼠BMDC成熟，促使BMDC高表達(dá)細(xì)胞表面分子（MHCII、CD86和 CD40）以及分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-12p40。
　　4. rDnaJ蛋白通過(guò)TLR4受體誘導(dǎo)小鼠BMDC成熟，與TLR2無(wú)關(guān)。
　　5.rDnaJ蛋白通過(guò)p38、ERK、JNK、PI3K-A

10、kt和NF-κB等信號(hào)通路誘導(dǎo)小鼠BMDC成熟。
　　6. rDnaJ蛋白通過(guò)TLR4刺激成熟的小鼠BMDC使初始CD4+T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞極化，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生Th1和Th17型免疫應(yīng)答。
　　結(jié)論：
　　本研究表明rDnaJ蛋白能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的BMDC免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答是通過(guò)TLR4受體而不是TLR2受體、在MAPK、PI3K-Akt和NF-κB多條信號(hào)通路的參與下完成的。成熟BMDC可以使初始T細(xì)胞向Th1