左旋咪唑體外調(diào)節(jié)樹突狀細胞誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答的分子機制初探.pdf

1、左旋咪唑(LMS)作為佐劑，能夠誘導(dǎo)抗原呈遞細胞產(chǎn)生炎性因子和上調(diào)共刺激分子CD80和CD86的表達，但對于左旋咪唑如何加強Th1細胞免疫的細胞學(xué)基礎(chǔ)及其分子機制仍未確定。那么左旋咪唑作佐劑是否通過TLRs介導(dǎo)的信號通路調(diào)控樹突狀細胞的成熟，從而產(chǎn)生誘導(dǎo)Th1型細胞因子的微環(huán)境，從而增強Th1型免疫應(yīng)答，到目前尚未見此方面的相關(guān)研究報道。因此，本項目擬對左旋咪唑佐劑在提高機體細胞免疫尤其是Th1型細胞免疫應(yīng)答的機理作一探索。
　　

2、以DC表面的TLRs為靶位，研究左旋咪唑佐劑與DC相互作用的效應(yīng)，并在此基礎(chǔ)上探討二者相互作用的受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，旨為佐劑作用的機理研究和新型疫苗研制和應(yīng)用提供新的資料。
　　首先使用骨髓來源細胞因子(GM-CSF、IL-4)誘生法培養(yǎng)樹突狀細胞，LMS刺激細胞后，采用光學(xué)顯微鏡觀察法、流式細胞術(shù)及ELISA法，分別觀察細胞形態(tài)、檢測細胞表面分子及細胞因子，對樹突狀細胞進行鑒定;其次采用MTT法檢測LMS刺激成熟的樹突狀細胞誘導(dǎo)

3、脾臟Na(i)ve T細胞活化增殖效應(yīng)，并通過ELISA法檢測樹突狀細胞、T細胞共培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4的分泌量來初步確定T細胞分化方向;最后通過Real-time PCR、Western blotting檢測LMS刺激成熟樹突狀細胞表面TLR2、4、6、9，并且通過抑制劑試驗進一步確定TLRs，之后Real-time PCR、Western blotting檢測信號通路中下游信號接頭分子MyD88及核轉(zhuǎn)錄因子NF-B來確定LM

4、S刺激DC成熟信號通路。
　　結(jié)果如下:1、體外成功培養(yǎng)出小鼠骨髓來源樹突狀細胞前體細胞，在LMS刺激下可大量表達表面特異性分子(CD11C、MHC-Ⅱ)和共刺激分子(CD80和86)并且高表達細胞因子IL-12p70，由此證明左旋咪唑可以在體外誘導(dǎo)DC成熟。2、體外試驗證實LMS刺激成熟的DC可以誘導(dǎo)Na(i)ve T細胞活化增殖，ELISA檢測活化的T細胞大量分泌IFN-γ而IL-4的分泌量基本無變化，初步表明成熟的DC誘導(dǎo)N

5、a(i)ve T細胞向Th1型細胞分化。3、Real-time PCR、Western blotting檢測LMS刺激成熟DC高表達TLR2，anti-TLR2處理DC前體細胞后再使用LMS刺激IL-12p70表達量顯著下降，由此證明LMS刺激未成熟DC成熟有TLR2的參與。4、左旋咪唑通過TLR2激活樹突狀細胞成熟后，信號通路接頭分子MyD88及轉(zhuǎn)錄因子NF-B的表達均上調(diào)，由此證明LMS刺激未成熟DC成熟有TLR2介導(dǎo)的信號通路的參