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1、左旋咪唑(LMS)作為佐劑,能夠誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子和上調(diào)共刺激分子CD80和CD86的表達(dá),但對(duì)于左旋咪唑如何加強(qiáng)Th1細(xì)胞免疫的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)及其分子機(jī)制仍未確定。那么左旋咪唑作佐劑是否通過(guò)TLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)控樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟,從而產(chǎn)生誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子的微環(huán)境,從而增強(qiáng)Th1型免疫應(yīng)答,到目前尚未見(jiàn)此方面的相關(guān)研究報(bào)道。因此,本項(xiàng)目擬對(duì)左旋咪唑佐劑在提高機(jī)體細(xì)胞免疫尤其是Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答的機(jī)理作一探索。
2、以DC表面的TLRs為靶位,研究左旋咪唑佐劑與DC相互作用的效應(yīng),并在此基礎(chǔ)上探討二者相互作用的受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,旨為佐劑作用的機(jī)理研究和新型疫苗研制和應(yīng)用提供新的資料。
首先使用骨髓來(lái)源細(xì)胞因子(GM-CSF、IL-4)誘生法培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞,LMS刺激細(xì)胞后,采用光學(xué)顯微鏡觀察法、流式細(xì)胞術(shù)及ELISA法,分別觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞表面分子及細(xì)胞因子,對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行鑒定;其次采用MTT法檢測(cè)LMS刺激成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)
3、脾臟Na(i)ve T細(xì)胞活化增殖效應(yīng),并通過(guò)ELISA法檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞共培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4的分泌量來(lái)初步確定T細(xì)胞分化方向;最后通過(guò)Real-time PCR、Western blotting檢測(cè)LMS刺激成熟樹(shù)突狀細(xì)胞表面TLR2、4、6、9,并且通過(guò)抑制劑試驗(yàn)進(jìn)一步確定TLRs,之后Real-time PCR、Western blotting檢測(cè)信號(hào)通路中下游信號(hào)接頭分子MyD88及核轉(zhuǎn)錄因子NF-B來(lái)確定LM
4、S刺激DC成熟信號(hào)通路。
結(jié)果如下:1、體外成功培養(yǎng)出小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞前體細(xì)胞,在LMS刺激下可大量表達(dá)表面特異性分子(CD11C、MHC-Ⅱ)和共刺激分子(CD80和86)并且高表達(dá)細(xì)胞因子IL-12p70,由此證明左旋咪唑可以在體外誘導(dǎo)DC成熟。2、體外試驗(yàn)證實(shí)LMS刺激成熟的DC可以誘導(dǎo)Na(i)ve T細(xì)胞活化增殖,ELISA檢測(cè)活化的T細(xì)胞大量分泌IFN-γ而IL-4的分泌量基本無(wú)變化,初步表明成熟的DC誘導(dǎo)N
5、a(i)ve T細(xì)胞向Th1型細(xì)胞分化。3、Real-time PCR、Western blotting檢測(cè)LMS刺激成熟DC高表達(dá)TLR2,anti-TLR2處理DC前體細(xì)胞后再使用LMS刺激IL-12p70表達(dá)量顯著下降,由此證明LMS刺激未成熟DC成熟有TLR2的參與。4、左旋咪唑通過(guò)TLR2激活樹(shù)突狀細(xì)胞成熟后,信號(hào)通路接頭分子MyD88及轉(zhuǎn)錄因子NF-B的表達(dá)均上調(diào),由此證明LMS刺激未成熟DC成熟有TLR2介導(dǎo)的信號(hào)通路的參
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