miR--155在樹突狀細胞抗白念珠菌固有免疫應答中的調節(jié)作用及其機制研究.pdf

1、白念珠菌（Candida albicans，C.albicans）作為一類條件致病菌，主要寄居在人體的皮膚和粘膜（如口腔、消化道和陰道）表面。在機體免疫功能正常時，白念珠菌與免疫系統(tǒng)維持相對穩(wěn)態(tài)，不會引發(fā)感染;而當機體的免疫功能受到抑制時，白念珠菌與機體共存的穩(wěn)態(tài)被打破，白念珠菌迅速繁殖，由共生菌轉為致病菌。白念珠菌感染作為最常見的真菌感染，可有不同的臨床表現(xiàn)，輕者常引發(fā)局部粘膜損傷，重者可穿透組織、侵入外周血液循環(huán)，表現(xiàn)為播散性念珠菌

2、病，嚴重威脅患者生命。近些年來，由于抗生素濫用的現(xiàn)象仍未得到有效解決，且腫瘤放化療患者以及HIV感染病人的日益增多，導致白念珠菌感染的發(fā)病率不斷增高，而且播散性感染的病死率居高不下，這些至今仍是難以解決的臨床問題。因此，研究白念珠菌的致病機制、特別是深入研究機體免疫系統(tǒng)抗白念珠菌感染的調控過程，可為其相關的感染性疾病的治療提供幫助。
　　機體抵抗白念珠菌感染的第一道防線是由樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)、中性

3、粒細胞、巨噬細胞等組成的固有免疫應答系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以在第一時間通過非特異殺傷的方式清除致病菌，但持續(xù)時間不長而且不具備免疫記憶功能。DCs作為專職的抗原遞呈細胞(antigen presenting cells，APCs)，其表面表達較高水平的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)。這些PRRs的主要生物學功能在于可以識別病原體表面的保守結構，即病原體相關分子模式(pathogen-asso

4、ciated molecular patterns，PAMPs)，并由此開啟針對病原體感染的免疫應答。白念珠菌細胞壁的PAMPs一旦被DCs表面的PRRs識別，可迅速活化DCs，分泌多種炎癥因子和趨化因子，促進對白念珠菌的非特異性免疫清除。DCs的活化機制十分復雜，其核心事件是NF-κB、核轉錄因子激活蛋白-1（nuclear transcription factor activation protein-1，AP-1）等轉錄因子的核轉

5、位，最終調節(jié)多種細胞因子和趨化因子的表達。另一方面，DCs還可以通過PRRs吞噬病原體，并將病原體抗原加工、遞呈給T細胞，誘導T細胞分化，指導后續(xù)的特異性免疫應答的類型和持續(xù)時間。固有免疫是獲得性免疫的起點和驅動，而獲得性免疫可在固有免疫的基礎上發(fā)揮更持久且具有記憶功能的免疫效應。值得注意的是，機體抗白念珠菌的免疫應答過程需要多種機制的精細調控，若免疫反應強度過弱，則無法有效清除病原體;但若免疫應答強度過高或持續(xù)時間太長，則容易導致機體

6、組織的炎癥性損傷。
　　microRNAs(miRNAs)是一類長度約20個堿基左右的單鏈非編碼RNA，可以與靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)(3'UTR)的堿基不完全互補結合，導致mRNA發(fā)生降解，或者直接抑制mRNA的蛋白質翻譯過程，從而發(fā)揮轉錄后水平的調節(jié)作用。miRNAs的作用特點是一個miRNA可以同時在轉錄后水平對多個基因進行調節(jié)，而一個基因的表達強度也可以受到多個miRNAs的調節(jié)，miRNAs對靶基因的調節(jié)具有明顯的時

7、空特異性。近些年來，越來越多的研究表明，miRNAs在免疫細胞的發(fā)育和免疫應答的進程中發(fā)揮不可忽視的調控作用。在前期的研究中，我們采用microRNA芯片分析了白念珠菌刺激單核源DCs內miRNAs的表達譜變化，結果發(fā)現(xiàn)多種miRNAs異常表達，其中miR-155表達顯著上調。再者，以往的研究表明miR-155在抗細菌、病毒的免疫反應中具有活躍的調節(jié)功能，但目前miR-155在真菌感染免疫中的生物學功能尚不明確?；谝陨涎芯勘尘?，本課題

8、探討了miR-155在樹突狀細胞抗白念珠菌感染的固有免疫應答中的調節(jié)作用及其作用機制。
　　第一部分 熱滅活的白念珠菌對樹突狀細胞及CD4+Th細胞的活化作用及功能影響
　　目的:研究白念珠菌感染對樹突狀細胞的成熟及其功能的影響，進而對CD4+Th細胞的活化和分化的影響。
　　方法:采用磁珠分選的方法從人外周血中分離CD14+單核細胞和CD4+Th細胞，加入GM-CSF和IL-4誘導CD14+單核細胞分化為未成熟的DC

9、s。用熱滅活的白念珠菌刺激DCs，檢測DCs的成熟表面標志物的表達及炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的分泌。然后將負載了白念珠菌的DCs與CD4+Th細胞共培養(yǎng)，通過流式細胞術檢測Th細胞的活化及IFN-γ、IL-17等細胞因子的表達變化。
　　結果:熱滅活的白念珠菌可以顯著上調DCs表面的成熟標志物CD83、CD86的表達，促進細胞因子IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的釋放

10、。負載白念珠菌的DCs與CD4+Th細胞共培養(yǎng)后，T細胞表面的活化標志物CD69表達上調，胞內細胞因子IFN-γ、IL-17的分泌水平明顯升高。
　　結論:熱滅活的白念珠菌可以促進樹突狀細胞成熟，并誘導CD4+Th細胞活化分化，發(fā)揮有效的抗真菌效應。
　　第二部分 熱滅活的白念珠菌可以上調樹突狀細胞內miR-155的表達
　　目的:研究熱滅活白念珠菌能否促進miR-155的表達和分泌。
　　方法:用熱滅活的白念珠

11、菌刺激DCs，qRT-PCR檢測胞內miR-155的表達。收集白念珠菌刺激DCs后的培養(yǎng)上清液，并提取外泌體，檢測上清液和外泌體中miR-155的表達。通過qRT-PCR檢測白念珠菌刺激DCs后不同時間點炎癥因子的變化情況，以及在DCs、單核細胞、THP-1細胞和RAW264.7細胞中miR-155的表達變化。
　　結果:熱滅活的白念珠菌可以顯著上調DCs內miR-155的表達，并且白念珠菌刺激DCs的培養(yǎng)上清及外泌體中miR-1

12、55表達也明顯上調。白念珠菌誘導的炎癥因子的表達呈先升高后降低的趨勢，而miR-155的表達呈持續(xù)上升趨勢，后期與炎癥因子的表達趨勢相反。此外，在單核細胞、THP-1和RAW264.7細胞內，白念珠菌同樣可以持續(xù)上調細胞內miR-155的表達。
　　結論:熱滅活的白念珠菌可以持續(xù)上調miR-155的表達，且miR-155可以通過外泌體分泌到細胞外基質中。同時白念珠菌刺激下炎癥因子的表達呈先升高后降低的趨勢，在炎癥后期與miR-15

13、5的表達趨勢相反。
　　第三部分 miR-155對DCs分泌炎癥因子的調節(jié)作用及機制研究
　　目的:探究miR-155對白念珠菌誘導的DCs分泌炎癥因子的調節(jié)作用以及分子機制。
　　方法:將miR-155的模擬體和抑制體轉染DCs，然后加入熱滅活的白念珠菌，分別采用qRT-PCR和ELISA檢測炎癥因子IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的變化。采用生物信息學軟件TargetS can、miRDB和microR

14、NA.org預測miR-155的靶基因，并通過western blotting和熒光素酶報告基因的方法檢測miR-155對靶基因的調節(jié)作用，最后轉染siRNA干擾靶基因的表達，檢測對下游炎癥因子分泌的影響。
　　結果:轉入miR-155的模擬體后，白念珠菌誘導的炎癥因子IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的分泌明顯降低;而轉入miR-155的抑制體后，炎癥因子的變化趨勢與之相反。在白念珠菌刺激的DCs中，miR-155可以

15、與轉錄因子NF-κB p65和上游BCL10的3'UTR端靶向結合抑制其表達。此外，干擾BCL10可明顯抑制NF-κB信號通路的激活，減弱白念珠菌上調炎癥因子的表達能力。
　　結論:在白念珠菌感染中，持續(xù)表達上調的miR-155對炎癥因子的分泌具有明顯的負向調節(jié)作用，其作用機制可能與靶向抑制BCL10及NF-κBp65的表達，進一步影響NF-κB通路的激活有關。
　　第四部分 白念珠菌活化的DCs內miR-155表達上調的機

16、制研究
　　目的:探究熱滅活白念珠菌上調miR-155表達的相關機制。
　　方法:加入Dectin-1的激動劑，采用qRT-PCR檢測miR-155的表達變化。在白念珠菌刺激DCs前加入Dectin-1的抑制劑或siRNA預處理，然后檢測miR-155的表達變化。分別采用細胞免疫熒光、Western blotting檢測熱滅活白念珠菌刺激DCs后轉錄因子NF-κB p65的核轉位情況以及MAPK信號通路相關分子的磷酸化表達。

17、在白念珠菌刺激的DCs之前預先加入NF-κB或MAPK信號通路的特異性抑制劑，研究這兩條通路對白念珠菌上調miR-155表達的影響。
　　結果:加入Dectin-1的激動劑可以明顯上調miR-155的表達，而加入Dectin-1受體的特異性阻斷劑或siRNA均會抑制白念珠菌上調miR-155表達的能力。熱滅活的白念珠菌可以促進NF-κB p65的磷酸化和核轉位，并激活MAPK的ERK、JNK通路及下游轉錄因子c-Jun的磷酸化;進