白念珠菌誘導人單核細胞白血病細胞(THP-1細胞)固有免疫應答機制的初步研究.pdf

1、第一章人單核細胞白血病細胞(THP-1細胞)吞噬作用研究
　　目的：研究人單核細胞白血病細胞（THP-1細胞）對墨汁、白念珠菌的吞噬情況，初步探討肌動蛋白在吞噬過程中的作用。方法：以丙二醇甲醚醋酸酯(Propyleneglycol monomethyl ether acetate， PMA)誘導THP-1細胞為巨噬細胞，分別以適量墨汁、滅活的白念珠菌菌懸液與其進行共培養(yǎng)，觀察THP-1細胞吞噬情況。并以細胞松弛素-B(Cytoch

2、alasin-B，Cyt-B)對THP-1細胞預處理后，觀察細胞對白念珠菌吞噬情況。結(jié)果：經(jīng)PMA誘導后的THP-1細胞形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)胞對培養(yǎng)瓶的附著，并有多形性的細胞形狀。與墨汁、白念珠菌共培養(yǎng)后可見細胞內(nèi)出現(xiàn)大量墨汁、白念珠菌成分。經(jīng)Cyt-B預處理后的細胞不能吞噬白念珠菌，僅可見少量白念珠菌與細胞黏附。結(jié)論：THP-1細胞經(jīng)誘導為巨噬細胞后具有吞噬功能，白念珠菌可被誘導后的THP-1細胞吞噬;吞噬過程的發(fā)生依賴肌動蛋白的聚集。

3、
　　第二章白念珠菌誘導人單核細胞白血病細胞(THP-1細胞)產(chǎn)生前炎癥因子的初步研究
　　目的：研究白念珠菌對THP-1細胞分泌TNF-α、IL-6等前炎癥因子的影響。方法：實時熒光定量PCR分析不同濃度（105 CFU/ml、106 CFU/ml）滅活白念珠菌。脂多糖(LPS)刺激THP-1細胞后TNF-α、IL-6的mRNA表達水平變化;并以酶聯(lián)免疫吸附法檢測THP-1細胞與106 CFU/ml滅活白念珠菌、LPS共培

4、養(yǎng)后TNF-α、IL-6的分泌量。結(jié)果：105 CFU/ml白念珠菌組、106 CFU/ml白念珠菌組、陽性刺激物脂多糖(LPS)刺激THP-1細胞組以及空白對照組的TNF-μ mRNA、IL-6 mRNA表達水平進行雙因素方差分析，結(jié)果顯示不同組別的TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達水平有差異(F=110.983，P＜0.001;F=294.114，P＜0.001);刺激1、3、6h之間也有統(tǒng)計學意義(F=701.680，P

5、＜0.001;F=1036.557，P＜0.001);提示在6h內(nèi)白念珠菌上調(diào)TNF-α mRNA、IL-6 mRNA水平隨時間延長而增高，且白念珠菌組上調(diào)TNF-α mRNA、IL-6 mRNA水平表現(xiàn)為劑量依賴效應。106 CFU/ml白念珠菌刺激后24 h，白念珠菌組、LPS組、培養(yǎng)基對照組的上清液中TNF-α蛋白濃度分別為（6385.70±533.99）ng/L、（3212.06±353.00）ng/L、（147.10±0.53

6、）ng/L，三者之間差異有統(tǒng)計學意義(n=8，F(xiàn)=71.25，P＜0.01)，白念珠菌組、LPS組分別與培養(yǎng)基對照組比較，TNF-α蛋白分泌量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P分別為＜0.01、＜0.05)。106 CFU/ml白念珠菌刺激后24 h，白念珠菌組、LPS組、培養(yǎng)基對照組的上清液中IL-6蛋白濃度分別為（924.90±30.13）ng/L、（286.10±6.12）ng/L、（10.47±0.07）ng/L，三者之間差異有統(tǒng)

7、計學意義(n=8，F(xiàn)=61.27，P＜0.01)，白念珠菌組、LPS組分別與培養(yǎng)基對照組比較，IL-6蛋白分泌量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P分別為＜0.01、＜0.01）。結(jié)論：THP-1細胞體外與白念珠菌作用后分泌TNF-α、IL-6水平明顯增高，且呈現(xiàn)劑量依賴效應與時間依賴效應，從而參與抗念珠菌感染固有免疫反應。
　　第三章白念珠菌誘導活化人單核細胞白血病細胞(THP-1細胞)信號通路的初步研究
　　目的：探討白念珠

8、菌對THP-1細胞內(nèi)信號分子p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子κB(NF-κB)激活的影響。方法：免疫印跡法分析106 CFU/ml滅活白念珠菌體外作用THP-1細胞30min、1h后p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平及IBα和磷酸化IκBα的水平。以106 CFU/ml滅活白念珠菌菌懸液、LPS刺激THP-1細胞后，以免疫熒光法觀察NF-κB核轉(zhuǎn)位。同時設置地塞米松抑制組，以同樣的方法檢測p38MAPK和磷酸化p38

9、MAPK的水平;并以實時熒光定量PCR法檢測地塞米松預處理后THP-1細胞TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達水平的變化。結(jié)果：106 CFU/ml白念珠菌作用于THP-1細胞30min、60 min后磷酸化p38MAPK、磷酸化IκBα蛋白水平明顯升高。培養(yǎng)基對照組中，p65處于細胞質(zhì)內(nèi);白念珠菌及LPS誘導刺激后，核內(nèi)出現(xiàn)p65。地塞米松抑制組可降低白念珠菌對磷酸化P38MAPK的激活水平。40μg/L地塞米松預先與THP-

10、1細胞共培養(yǎng)30 min后，再以106 CFU/ml白念珠菌刺激6h檢測TNF-α mRNA表達水平(3.77±0.62)較未用地塞米松組(208.50±10.50)明顯降低，IL-6 mRNA表達水平（12.66±1.63）較未用地塞米松組（584.43±16.80）明顯降低。地塞米松可阻斷白念珠菌上調(diào)TNF-αmRNA、IL-6 mRNA表達水平。結(jié)論：THP-1細胞體外與白念珠菌作用后可激活信號分子p38MAPK、NF-κB，并分

11、泌TNF-μ、IL-6等前炎癥因子，參與抗念珠菌感染固有免疫反應。
　　第四章白念珠茵誘導人單核細胞白血病細胞(THP-1細胞)C型凝集素-1受體(Dectin-1)表達的初步研究
　　目的：探討白念珠菌刺激THP-1細胞后能否引起Dectin-1受體表達量發(fā)生變化。方法：流式細胞術(shù)檢測THP-1細胞經(jīng)不同時間點滅活白念珠菌菌懸液、Curdlan（一種β-葡聚糖）刺激后Dectin-1受體的表達水平。結(jié)果：白念珠菌、Curd

12、lan刺激THP-1細胞3h后，Dectin-1受體表達量較對照組無明顯變化，自6h起其表達量逐漸升高，6h組、12h組、24h組與對照組相比均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);且白念珠菌上調(diào)Dectin-1受體表達水平呈時間-效應關(guān)系，隨著刺激時間的延長，表達量逐漸升高，至24h仍處于較高水平。結(jié)論：THP-1細胞體外與白念珠菌作用后可促使Dectin-1受體表達量增高。THP-1細胞可能通過增高Dectin-1受體的表達水平，并活化下游