白念珠菌分泌的誘導人單核細胞凋亡的新因子的初步純化和鑒定.pdf

1、目的:本研究我們將觀察從白念珠菌培養(yǎng)上清液中分離到的一種新型毒力因子分泌型IL-12抑制因子(Secretary IL-12 Inhibitory Factor，SIIF)對人類單核細胞增殖率的影響和誘導凋亡情況，檢測其誘導凋亡活性。觀察SIIF蛋白結合于人類單核細胞的部位。明確SIIF的蛋白序列和基因序列，篩選出可疑蛋白，有助于后期SIIF蛋白作用機制的研究及將來有可能采取特異性干擾SIIF蛋白活性的治療方案來控制局部及系統(tǒng)性的白念珠

2、菌感染。
　　方法:白念珠菌菌株選自前期試驗中收集念珠菌性陰道炎(vulvovaginal candidiasis，VVC)患者陰道分泌物經直接鏡檢、接種培養(yǎng)形態(tài)學鑒定及提取DNA檢索基因組數據庫均鑒定為白念珠菌的菌株。人類單核細胞選用人急性單核細胞白血病細胞系(The Human acutemonocytic leukemia cell line，THP-1)。將選定的白念珠菌接種于含有20mlRPMI1640培養(yǎng)液的離心管中，

3、置于37度恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，經兩次純化后接種于含有500mlRPMI1640液體培養(yǎng)基燒瓶中，繼續(xù)37度恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)后收集培養(yǎng)上清液，分裝入離心管中離心除去白念珠菌，離心后的上清液經除菌濾過器(0.22μ m)再次除菌，將培養(yǎng)上清液加入Centricon-70蛋白濃縮器（截留分子量大于30KDa的蛋白分子）中離心濃縮得到SIIF蛋白，BCA法測定蛋白濃度后-80度保存?zhèn)溆?。實驗根據是否在培養(yǎng)的人單核細胞中加入

4、SIIF蛋白分為實驗組和對照組，實驗組SIIF蛋白終濃度為400μg/ml。SIIF蛋白與THP-1細胞共同培養(yǎng)24小時后GENMED XTT法分別檢測實驗組和對照組450nm波長處吸光度值并根據吸光度值計算出實驗組相對對照組細胞增殖率;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細胞儀(Flow cytometry，FCM)分別檢測實驗組和對照組THP-1細胞早期凋亡率;ConA-FITC/DAPI雙染法熒光顯微鏡觀察SIIF蛋白結合于

5、細胞部位;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離純化SIIF蛋白，電泳后的SDS-PAGE條帶經胰蛋白酶酶解后進行液相色譜-串聯質譜法(liquid chromatography-tandem massspectrometric，LC-MS/MS)分析，然后采用Mascot軟件檢索NCBInr數據庫獲得

6、與肽段匹配的相關蛋白及其基因序列，最后根據蛋白分子量大小、評分及相關功能綜合評價篩選出可疑蛋白。測得的THP-1細胞增殖率及細胞早期凋亡率應用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計分析。
　　結果:1.GENMEDXTT法檢測顯示SIIF蛋白作用于THP-1細胞24小時后，450nm處吸光度值明顯低于對照組，實驗組相對對照組細胞增殖率也明顯低于對照組，與對照組細胞增殖率相比較差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.026＜0.05)。2.Annexi

7、nⅤ-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測顯示SIIF蛋白作用于THP-1細胞24小時后，實驗組細胞早期凋亡率為(11.867±1.604)％，明顯高于對照組(5.300±0.265)％，與對照組早期凋亡率相比較差異具有顯著性意義(P=0.002＜0.01)。3.ConA-FITC/DAPI雙染熒光顯微鏡觀察顯示，SIIF蛋白所在位置的綠色熒光與DAPI所在細胞核位置的藍色熒光完全重合，說明SIIF蛋白進入THP-1細胞后結合于細胞核。4.

8、SIIF蛋白經SDS-PAGE分離、胰蛋白酶酶解及液相色譜-串聯質譜法分析后，根據蛋白分子量大小、評分及功能綜合評價后，我們將分泌型天冬氨酸蛋白酶6(Secretedaspartyl proteinase, Sap6)和Rbt4p(repressed by TUP1 protein4)兩種蛋白作為SIIF候選蛋白。
　　結論:1.SIIF蛋白能抑制THP-1細胞增殖。2.SIIF蛋白具有誘導THP-1細胞凋亡的活性。3.SIIF蛋