白念珠菌對巨噬細(xì)胞凋亡及其TLR-2受體表達(dá)影響的研究.pdf

1、巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)重要的細(xì)胞成分，在機(jī)體抗白念珠菌(Candida albicans，Ca)感染中起著重要的作用。感染白念珠菌后的巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生多種細(xì)胞因子(cytokine,CK)、吞噬溶酶體融合等機(jī)制介導(dǎo)殺滅白念珠菌，TOLL樣受體（Toll like receptors,TLRs）的信號傳導(dǎo)作用也為機(jī)體提供了重要的免疫保護(hù)作用。白念珠菌具有二相性，白念珠菌菌絲相形成被認(rèn)為是毒力因素之一，分泌型天冬氨酸蛋白酶（Secreted

2、 asparty1 protainase,SAP）是白念珠菌產(chǎn)生的胞外酶，也被認(rèn)為是白念珠菌的毒力因素之一，可被胃蛋白酶抑制劑（pepstatin，PEP）所抑制。研究發(fā)現(xiàn)酵母相白念珠菌可致巨噬細(xì)胞凋亡，天冬氨酸蛋白酶可能是白念珠菌致巨噬細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因子。通過觀察酵母相白念珠菌（Y-Candida）、菌絲相白念珠菌（H-Candida）、胃蛋白酶抑制劑處理的白念珠菌對巨噬細(xì)胞TLR-2表達(dá)的影響、對巨噬細(xì)胞凋亡及細(xì)胞因子分泌的影響，探

3、討菌絲相白念珠菌是否致巨噬細(xì)胞凋亡、菌絲相白念珠菌和酵母相白念珠菌致巨噬細(xì)胞凋亡率是否有差異，以及它們對巨噬細(xì)胞TLR-2的表達(dá)的影響有無差異，以進(jìn)一步探討白念珠菌的致病因子及致病機(jī)制，并且為疾病的預(yù)防和治療提供新思路。
　　用普通沙保弱培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母相白念珠菌，用豐富培養(yǎng)基（YPD）培養(yǎng)白念珠菌48h，再以5×106/ml的菌濃度培養(yǎng)于含10％小牛血清(New born bovine serum，NBS)1640培養(yǎng)液37℃5%

4、CO2培養(yǎng)3h，誘導(dǎo)純度較高的菌絲相白念珠菌，以30μg/ml作用濃度的胃蛋白酶抑制劑預(yù)處理白念珠菌30min；分別利用酵母相白念珠菌、菌絲相白念珠菌及用胃蛋白酶抑制劑預(yù)處理的白念珠菌作為刺激信號，與佛波醇酯(Phorbo12-myristate13-acetate，PMA)刺激后分化的THP-1細(xì)胞建立感染模型；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況；酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)

5、檢測細(xì)胞因子TNF-α分泌情況；Griess反應(yīng)法檢測一氧化氮(Enzyme linked immunosorbent assay，NO)量（NO2-/NO3-比值）；半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測細(xì)胞表面的TLR-2 mRNA表達(dá)的水平。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)：可以通過pH值為7.0的含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液，37℃5%

6、CO2培養(yǎng)3h誘導(dǎo)出較純（﹥90％）的白念珠菌菌絲(hyphal)；分別以5：1效靶比的酵母相白念珠菌、菌絲相白念珠菌、PEP預(yù)先處理的白念珠菌感染巨噬細(xì)胞1h、2h、4h和8h，酵母相白念珠菌組巨噬細(xì)胞凋亡率分別為（4.27±0.40）％、（17.61±0.92）％、（23.38±1.31）％和（27.63±1.06）％，菌絲相白念珠菌組巨噬細(xì)胞凋亡率分別為（7.42±0.55）％、（22.78±1.30）％、（31.96±1.08）

7、％和（40.43±1.66）％，均較空白對照組（0.93±0.11）％、（1.41±0.36）％、（3.38±0.37）％和（6.16±0.62）％明顯升高，方差分析P＜0.01；蛋白酶抑制劑預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率分別為（1.12±0.15）％、（2.78±0.45）％、（7.24±0.0.72）％和（13.41±0.76）％，較空白對照組差異有顯著性（P﹤0.05）；不同處理組巨噬細(xì)胞凋亡率兩兩比較差異亦有顯著性（P﹤0.05）。

8、　　以5：1效靶比白念珠菌作用巨噬細(xì)胞1h、2h、4h和8h。胃酶抑制劑處理白念珠菌及酵母相和菌絲相白念珠菌組自1 h起巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-?的量均高于同時間段空白對照組（P<0.01）,且不同作用組分泌的TNF-?的量兩兩比較亦有顯著差異性（P<0.01）；1h起，酵母相組和菌絲相組分別與對照組、PEP作用組比較，巨噬細(xì)胞分泌NO水平均有顯著升高（P﹤0.01），2h起，菌絲相組與酵母相組比較NO水平有顯著升高（P﹤0.01），4h

9、起各實驗組兩兩比較均有顯著性差異（P﹤0.01）。
　　RT-PCR檢測巨噬細(xì)胞TLR-2 mRNA表達(dá)：胃蛋白酶抑制劑處理的白念珠菌及酵母相和菌絲相白念珠菌刺激巨噬細(xì)胞4h后，酵母相組和菌絲相組TLR-2 mRNA表達(dá)量與空白對照組及PEP處理組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），且兩兩間比較有顯著性差異（P<0.05），胃蛋白酶抑制劑處理組的TLR-2表達(dá)量與對照組比較無顯著性差異（P﹥0.05）。
　　實驗結(jié)果表明：白