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文檔簡介
1、白念珠菌(Candida albicans)是一種人類常見的機會致病真菌,常導(dǎo)致免疫系統(tǒng)受損的人群粘膜表面或系統(tǒng)感染。白念珠菌至少有七種不同形態(tài),不同形態(tài)的菌落之間可以高頻率的相互轉(zhuǎn)換,不同形態(tài)之間轉(zhuǎn)換能力與白念珠菌致病能力密切相關(guān)。其中研究較多的是酵母形態(tài)-菌絲形態(tài)和白菌-灰菌形態(tài)轉(zhuǎn)換。
特定條件下釀酒酵母能進行侵入生長和絲狀生長,其調(diào)控機制已研究的比較清楚。為了研究白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)控是否也存在類似的機制,我們利用釀
2、酒酵母單倍體flo8缺失株,通過功能互補的方法篩選白念珠菌基因組文庫,以獲得白念珠菌形態(tài)發(fā)生相關(guān)的基因。我們篩選得到EAP2和CZF2等多個基因,EAP2和CZF2都能校正flo8缺失株侵入生長缺陷。EAP2基因編碼一個785個氨基酸的蛋白。氨基酸序列分析表明,Eap2的N端含有一個真菌特異性的Tos9結(jié)構(gòu)域,其主要特征是包括一個非常保守的序列模式(64KRWTDG69),是一個可能的PKA磷酸化位點。Eap2蛋白N-端有一個核定位信號
3、序列,GFP-Eap2融合表達發(fā)現(xiàn),Eap2定位于細胞核內(nèi)。CZF2編碼一個624個氨基酸的蛋白,屬于Gal4蛋白家族,其N-端含有一保守的C6型鋅指結(jié)構(gòu)Zn2Cys6DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
保守的MAPK途徑和cAMP/PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑均參與了釀酒酵母和白念珠菌形態(tài)發(fā)生的調(diào)控,利用釀酒酵母缺失株,我們分析了Eap2和Czf2的功能。在釀酒酵母雙倍體缺失株中,Eap2和Czf2都能校正ste12,ste7,tec1和flo8
4、在氮源缺乏條件下菌絲生長的缺陷。在釀酒酵母單倍體缺失株中,Eap2和Czf2能校正ste12,ste7,tec1和flo8在碳源缺乏條件下侵入生長的缺陷。說明Eap2和Czf2在釀酒酵母菌絲生長和侵入生長中的激活作用繞過了MAPK途徑和Flo8因子的需求。
Northern雜交分析表明,EAP2基因有兩個大小不同的轉(zhuǎn)錄本,分別為~2.5 kb和~3.9 kb。在WO-1灰菌細胞中EAP2兩個轉(zhuǎn)錄本都能表達,而在WO-1白菌
5、細胞中則檢測不到明顯的表達條帶。因此,在白灰轉(zhuǎn)換中EAP2呈現(xiàn)一種“全或無(all-or-none)”的雙穩(wěn)態(tài)表達模式。該結(jié)果暗示Eap2可能參與白念珠菌白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)控。
為了進一步研究Eap2在白念珠菌中的功能,我們構(gòu)建了eap2/eap2缺失株。在MTL純合型菌株中,EAP2基因的敲除阻擋了白菌向灰菌的轉(zhuǎn)換。將pACT1-EAP2導(dǎo)回缺失株,細胞重新獲得了白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的能力。說明EAP2是白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換所必需的
6、基因。MTL基因座不僅調(diào)控白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換,還調(diào)控白念珠菌交配過程。我們發(fā)現(xiàn)EAP2基因的敲除并沒有阻擋白念珠菌交配的進行,但是與野生型相比,交配效率明顯降低。
在白念珠菌MTL純合型菌株中過表達EAP2基因,細胞就鎖定在灰菌狀態(tài)。不管在30℃還是37℃培養(yǎng)EAP2基因過表達菌株,細胞仍然保持在灰菌狀態(tài)。白念珠菌MTL雜合型菌株中沒有白-灰轉(zhuǎn)換現(xiàn)象,細胞鎖定為白菌狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)過表達EAP2促進了MTL雜合型白菌向灰菌轉(zhuǎn)換。
7、因此,過表達EAP2能夠戰(zhàn)勝MTLa/α復(fù)合體對白菌向灰菌轉(zhuǎn)換的抑制作用。
白念珠菌的白-灰轉(zhuǎn)換是一種雙穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)換。白菌細胞一旦轉(zhuǎn)換為灰菌細胞,即能穩(wěn)定地傳遞數(shù)代;相反亦然。本研究中我們發(fā)現(xiàn),EAP2敲除阻斷了灰菌形成,在MTLa或MTLα鈍合型菌株中用ACT1啟動子過表達EAP2將細胞鎖定為灰菌狀態(tài),而在eap2缺失株中過表達EAP2卻不能穩(wěn)定于灰菌狀態(tài),說明ACT1啟動子過表達EAP2激活了內(nèi)源EAP2基因的表達,EAP
8、2內(nèi)源高表達是維持灰菌狀態(tài)所必需的。另外,在白念珠菌中EAP2的表達呈現(xiàn)為一種“全或無”的模式。因此,我們認為EAP2雙穩(wěn)態(tài)表達調(diào)控可能通過一種反饋調(diào)控機制進行。
我們檢測了EAP2基因在MTL雜合型白念珠菌多種缺失株中的表達情況。Northern雜交表明,在酵母形態(tài)和菌絲形態(tài)生長條件下,tup1和efg1缺失株中大小兩個轉(zhuǎn)錄本都有表達。nrg1缺失株中只有EAP2小的轉(zhuǎn)錄本表達。盡管EAP2基因在野生型白念珠菌SC531
9、4酵母形態(tài)和菌絲形態(tài)細胞中都檢測不到表達,但在tup1、nrg1和efg1等缺失株中的表達提示EAP2的轉(zhuǎn)錄受Tup1,Nrg1,Efg1等因子的抑制,而且Eap2可能參與酵母形態(tài)-菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)變的調(diào)控。
EAP2過表達抑制了白念珠菌MTL純合型細胞的菌絲形成。在MTL雜合型白菌細胞中,EAP2過表達也能部分抑制菌絲的形成;灰菌細胞中則完全抑制菌絲的形成。在雜合型eap2敲除株中,ACT1啟動子下表達的EAP2,不能使細胞穩(wěn)
10、定保持在灰菌狀態(tài),但是也不能形成菌絲,說明Eap2不僅參與白-灰轉(zhuǎn)換的調(diào)控,還參與菌絲生長的調(diào)控。
Tos9結(jié)構(gòu)域的主要特征是含有一個保守的潛在PKA磷酸化位點(64KRWTDG69)。在EMTL純合型菌株中,Tos9結(jié)構(gòu)域的缺失抵消了Eap2促進白茵向灰菌轉(zhuǎn)換的功能也解除了Eap2抑制菌絲生長的功能。為了進一步了解Tos9結(jié)構(gòu)域的功能作用,我們將PKA磷酸化位點67位的蘇氨酸(T)突變?yōu)楸彼?A)。T67A突變同樣消除
11、了Eap2促進白菌向灰菌轉(zhuǎn)換及其抑制菌絲生長的功能。說明PKA磷酸化位點(64KRWTDG69)對Eap2的功能非常重要,Eap2可能作用于cAMP/PKA途徑的下游。
Czf2是一個包括Zn(Ⅱ)2Cys6鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。與MTL雜合型野生型白念珠菌相比,CZF2在efg1,nrg1和tec1等突變株中表達量大大提高。為了研究Czf2在白色念珠菌形態(tài)發(fā)生中的功能作用,我們構(gòu)建了白念珠菌czf2缺失株。在液體含血清的培
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