白念珠菌鐵穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、白念珠菌是人體最常見的一種條件致病性真菌，能夠以共生和致病兩種狀態(tài)存在于宿主微環(huán)境內(nèi)。通常情況下，白念珠菌廣泛存在于自然界及人體皮膚、口腔、生殖道及胃腸道粘膜表面，當(dāng)機體免疫機能下降或正常寄居部位微生境失調(diào)時，容易引起淺層皮膚粘膜感染或者侵襲性感染，甚至危及生命。隨著白念珠菌比較基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的快速發(fā)展，對白念珠菌的致病機理和耐藥機制的研究取得了較大進(jìn)展，鑒定和闡述了多個重要毒力決定因素，包括酵母型-菌絲型形態(tài)轉(zhuǎn)換、white-

2、opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換、對宿主細(xì)胞的粘附和侵襲、胞外水解酶的分泌、生物膜的形成、pH感應(yīng)和調(diào)控能力、接觸感應(yīng)、向觸性生長和環(huán)境壓力應(yīng)答能力等，其中許多細(xì)胞應(yīng)答過程與胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。
　　鐵是絕大部分生物體必需的基本營養(yǎng)元素，能夠作為調(diào)控信號刺激生物體對外界環(huán)境作出應(yīng)答。一方面，從外環(huán)境中攝取鐵的能力是白念珠菌在宿主中定殖、存活和致病過程的重要影響因素;另一方面，胞內(nèi)過量鐵離子也容易通過芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生氧自由基等活性氧簇，對細(xì)胞產(chǎn)生

3、毒害作用。因此，白念珠菌逐漸進(jìn)化出一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)蔫F離子獲得、儲存、轉(zhuǎn)運和調(diào)控系統(tǒng)來維持胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)，避免鐵離子濃度波動對細(xì)胞產(chǎn)生損傷。近年來，關(guān)于白念珠菌胞外鐵離子獲得系統(tǒng)的研究取得了較大的進(jìn)展，許多鐵離子獲得相關(guān)基因的生物學(xué)功能已逐漸得到闡釋，但是白念珠菌胞內(nèi)鐵離子儲存轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的研究仍處于空白階段。此外，盡管本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Aft2轉(zhuǎn)錄因子具有潛在的鐵應(yīng)答調(diào)控效應(yīng)，但對其調(diào)控機理及參與的代謝過程尚不清楚。本研究針對以上幾個問題，鑒定并

4、闡釋了白念珠菌胞內(nèi)鐵離子儲存轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和Aft2轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的鐵應(yīng)答調(diào)控系統(tǒng)，同時探究其在白念珠菌壓力應(yīng)答、形態(tài)發(fā)生和致病過程中的重要作用，為臨床上治療白念珠菌感染和新型抗真菌藥物開發(fā)提供重要的參考價值。本研究主要結(jié)果如下:
　　(1)采用生物信息學(xué)和分子細(xì)胞生物學(xué)方法，在白念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫中檢索并鑒定出線粒體膜轉(zhuǎn)運蛋白Mrs4、液泡膜轉(zhuǎn)運蛋白Ccc1和液泡膜轉(zhuǎn)運蛋白Smf3。研究發(fā)現(xiàn)，Mrs4蛋白屬于線粒體轉(zhuǎn)運蛋白家族成員，定位

5、于線粒體膜上，在維持線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)線粒體鐵轉(zhuǎn)運方面中發(fā)揮著重要作用。Ccc1蛋白主要負(fù)責(zé)向液泡中轉(zhuǎn)運鐵，而Smf3蛋白主要負(fù)責(zé)將液泡中儲存鐵釋放到胞質(zhì)中。三種轉(zhuǎn)運蛋白能夠形成Mrs4-Ccc1-Smf3(MCS)途徑，協(xié)同調(diào)控白念珠菌胞內(nèi)鐵離子的分配和轉(zhuǎn)運，在胞內(nèi)鐵應(yīng)答和利用等代謝過程中發(fā)揮著重要作用。
　　(2)采用PCR介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，分別構(gòu)建了mrs4Δ/Δ、ccc1Δ/Δ、smf3Δ/Δ單基因缺失菌株和mrs4Δ

6、/Δsmf3Δ/Δ、mrs4Δ/Δccc1Δ/Δ雙基因缺失菌株。研究發(fā)現(xiàn)，MRS4基因的缺失會擾亂白念珠菌胞內(nèi)鐵離子穩(wěn)態(tài)，提高細(xì)胞膜鐵獲得相關(guān)基因的表達(dá)水平，降低線粒體鐵利用相關(guān)基因的表達(dá)水平，從而增強細(xì)胞從胞外環(huán)境中獲得鐵的能力，并最終導(dǎo)致胞內(nèi)鐵含量水平的升高。在mrs4Δ/Δ缺失菌株基礎(chǔ)上進(jìn)一步敲除液泡鐵轉(zhuǎn)出蛋白Smf3后，會進(jìn)一步加重胞內(nèi)鐵含量水平的積累，而在mrs4Δ/Δ缺失菌株基礎(chǔ)上進(jìn)一步敲除液泡鐵轉(zhuǎn)入蛋白Ccc1后，能顯著降

7、低胞內(nèi)鐵含量水平，使其恢復(fù)至野生型水平。此外，MCS途徑在白念珠菌適應(yīng)性生長、低鐵和高鐵應(yīng)答、離子穩(wěn)態(tài)、氧化脅迫、線粒體呼吸、鐵硫簇合成、mtDNA穩(wěn)定性、線粒體膜電勢穩(wěn)定性、細(xì)胞壁完整性、抗真菌藥物耐受性、形態(tài)轉(zhuǎn)換、上皮細(xì)胞粘附侵染和毒力等細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用。上述結(jié)果提示，MCS途徑能維持胞內(nèi)鐵離子的穩(wěn)態(tài)，可能作用機理:MCS途徑協(xié)同調(diào)控胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)過程，Mrs4負(fù)責(zé)向線粒體中轉(zhuǎn)入鐵以供細(xì)胞利用，Ccc1負(fù)責(zé)向液泡中轉(zhuǎn)入鐵以供細(xì)胞

8、儲存，而Smf3負(fù)責(zé)將液泡中鐵活化釋放至胞質(zhì)中。胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的破壞會嚴(yán)重削弱菌株應(yīng)答外界環(huán)境信號的能力，并導(dǎo)致線粒體功能的失調(diào)，從而引發(fā)一系列的相互作用的損傷，影響許多重要的細(xì)胞過程，如細(xì)胞壁完整性、抗真菌藥物耐受性、形態(tài)發(fā)生和毒力等。
　　(3)白念珠菌Aft2轉(zhuǎn)錄因子在維持胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)過程中具有重要作用。采用原子吸收光譜技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，AFT2基因的缺失會降低菌株在低鐵條件下胞內(nèi)鐵含量水平。Rea1-Time PCR結(jié)果顯示，Aft

9、2是一種低鐵應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子，具有雙重調(diào)控作用，既能作為轉(zhuǎn)錄激活因子促進(jìn)FTR1、FET3、FRP1、CFL1和FET34等鐵代謝基因表達(dá)，也能作為轉(zhuǎn)錄抑制因子阻遏MRS4、SIT1、SMF3和HAP43等鐵代謝基因的表達(dá)。通過定點突變技術(shù)和構(gòu)建LacZ報告質(zhì)粒方法，研究發(fā)現(xiàn)Aft2轉(zhuǎn)錄因子能夠以基因劑量依賴的方式，通過CACCC保守應(yīng)答元件負(fù)向調(diào)控MRS4鐵應(yīng)答基因的表達(dá)，從分子水平上初步揭示了Aft2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控鐵代謝基因表達(dá)的可能機理

10、。蛋白定位實驗表明，在低鐵條件下，白念珠菌Aft2轉(zhuǎn)錄因子能夠從胞漿轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核內(nèi)，從細(xì)胞水平上提供了Aft2轉(zhuǎn)錄因子參與鐵代謝基因表達(dá)調(diào)控的又一證據(jù)。
　　(4)除參與調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)過程外，白念珠菌Aft2轉(zhuǎn)錄因子在環(huán)境壓力應(yīng)答及形態(tài)發(fā)生過程中也發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Aft2轉(zhuǎn)錄因子以非鐵依賴性機制參與氧化壓力應(yīng)答過程。在氧化壓力條件下，AFT2基因的缺失導(dǎo)致胞內(nèi)ROS的聚集，并誘導(dǎo)SOD酶活性，提示生長缺陷可能是由于胞內(nèi)ROS

11、過度聚集而無法有效清除造成的。采用絮凝實驗、疏水性測定以及粘附能力測定實驗，發(fā)現(xiàn)AFT2基因的缺失影響白念珠菌細(xì)胞表面特性，不僅會引起菌株絮凝能力的增強，同時也增強菌株細(xì)胞表面的疏水性以及對聚苯乙烯等材料的吸附能力。菌絲誘導(dǎo)實驗表明，Aft2轉(zhuǎn)錄因子既能作為正向調(diào)控因子參與固體誘導(dǎo)條件下的瓊脂侵入和形態(tài)發(fā)生過程，也能作為負(fù)向調(diào)控因子參與液體誘導(dǎo)條件下的形態(tài)發(fā)生過程。菌絲誘導(dǎo)信號能夠上調(diào)白念珠菌AFT2基因mRNA和蛋白表達(dá)水平，也能引起

12、Aft2蛋白細(xì)胞學(xué)定位的改變，使其細(xì)胞質(zhì)中被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核內(nèi)并聚集，為發(fā)揮調(diào)控作用提供必要條件。在嵌入應(yīng)答過程中，Aft2轉(zhuǎn)錄因子主要作為Czf1途徑的下游組分參與激活應(yīng)答過程，Efg1主要作為負(fù)向調(diào)控因子抑制Czf1和Aft2的激活活性。免疫共沉淀實驗揭示，在YPD正常條件下，Efg1蛋白和Czf1蛋白都能和Aft2蛋白具有物理性相互作用，當(dāng)誘導(dǎo)信號出現(xiàn)時，Czf1與Aft2蛋白仍然保持相互作用而Efg1與Aft2蛋白間相互作用出現(xiàn)解離