白念珠菌甘露多糖疫苗評(píng)價(jià)及白念珠菌侵入人內(nèi)皮和上皮細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察.pdf

1、白念珠菌是一種多邊芽殖酵母菌，它是造成免疫缺陷人群醫(yī)源性感染最主要的病原體之一。一般情況下，它是人類(lèi)常見(jiàn)的寄生菌，可存在于口咽、胃腸道和陰道粘膜表面。正常情況下，它并不引起人類(lèi)疾病。但是，當(dāng)宿主局部微環(huán)境失調(diào)或粘膜屏障受損時(shí)，白念珠菌可造成粘膜感染，引起鵝口瘡、霉菌性陰道炎、間擦疹等疾病。甚至在某些情況下，白念珠菌還可侵入粘膜上皮和血管內(nèi)皮引起易感人群血行播散性感染。
　　在引起上述疾病的過(guò)程中，白念珠菌與宿主細(xì)胞的相互作用貫穿始

2、終。白念珠菌細(xì)胞壁是直接與宿主細(xì)胞接觸的部分，含有大量可被機(jī)體識(shí)別的抗原。該菌細(xì)胞壁80-90％由糖類(lèi)組成。細(xì)胞壁的最外層是甘露聚糖與胞壁蛋白共價(jià)結(jié)合而成的糖肽結(jié)構(gòu)。既往研究發(fā)現(xiàn)，白念珠菌胞壁糖蛋白結(jié)構(gòu)包含以α1，6鍵形成的甘露糖骨架和部分磷酸化的β-1，2鍵甘露聚糖為主的側(cè)鏈。當(dāng)用念珠菌胞壁甘露聚糖抗原復(fù)合物免疫小鼠后，可顯著延長(zhǎng)白念珠菌播散性感染模型小鼠的生存時(shí)間。但是，甘露聚糖為T(mén)細(xì)胞非依賴(lài)性2型抗原，缺乏有效的免疫原性，不能誘導(dǎo)

3、機(jī)體產(chǎn)生足夠的抗體。
　　為了研發(fā)有效的抗真菌甘露聚糖疫苗，合成了鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)與β-甘露二糖、三糖和四糖偶聯(lián)形成的糖肽化合物。同時(shí)，通過(guò)軟件設(shè)計(jì)，還從白念珠菌毒力蛋白Als1中截取特異性表位短肽，并將其與糖肽疫苗偶聯(lián)，從而提供額外的抗原表位。Als1是白念珠菌胞壁蛋白，可以介導(dǎo)白念珠菌與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附。將上述糖肽化合物以聯(lián)合佐劑或不聯(lián)合佐劑的形式免疫小鼠，末次免疫2周后采取小鼠血清，評(píng)價(jià)人工合成糖肽化合物的免疫原性和免

4、疫反應(yīng)性。
　　研究發(fā)現(xiàn)，與KLH偶聯(lián)的甘露聚糖糖肽疫苗可以刺激小鼠產(chǎn)生針對(duì)相應(yīng)多糖的特異性抗體和針對(duì)Als1短肽的抗體。更有趣的是，與KLH偶聯(lián)的甘露聚糖糖肽化合物可以在無(wú)佐劑的情況下使小鼠產(chǎn)生相應(yīng)特異性抗體。但是，相比于甘露三糖和甘露二糖，甘露四糖糖肽疫苗并不能產(chǎn)生更高的抗體滴度。甘露三糖免疫的小鼠血清中的抗體可以識(shí)別白念珠菌的酵母和菌絲。同時(shí)，甘露三糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體還可識(shí)別熱帶念珠菌、光滑念珠菌和葡萄牙念珠菌四種臨床常見(jiàn)的念

5、珠菌，而甘露四糖和甘露二糖糖肽復(fù)合物刺激產(chǎn)生的抗體并不能識(shí)別這些念珠菌。除了β-(Man)3-KLH不聯(lián)合佐劑的情況下可以對(duì)白念珠菌播散性感染模型產(chǎn)生保護(hù)性，其他疫苗聯(lián)合/不聯(lián)合佐劑并不能延長(zhǎng)播散性念珠菌感染的小鼠生存時(shí)間。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明只有甘露三糖糖肽疫苗產(chǎn)生的抗體可以識(shí)別并保護(hù)白念珠菌所致的感染，甘露聚糖糖鏈過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都不能產(chǎn)生正確識(shí)別白念珠菌的抗體。
　　白念珠菌侵入宿主非吞噬細(xì)胞，如上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，在致病初期起至關(guān)重要的作

6、用。目前尚缺乏白念珠菌與上述宿主細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀察研究。采用活細(xì)胞實(shí)時(shí)觀測(cè)方法捕捉到白念珠菌與宿主細(xì)胞早期的相互作用過(guò)程。觀察到宿主細(xì)胞偽足形成在介導(dǎo)內(nèi)吞白念珠菌過(guò)程中起重要作用，依賴(lài)于白念珠菌菌絲特異蛋白Als3和宿主細(xì)胞骨架actin;而主動(dòng)入侵則依賴(lài)白念珠菌菌絲生長(zhǎng)。同時(shí)，觀察了介導(dǎo)內(nèi)吞和主動(dòng)入侵在白念珠菌進(jìn)入臨床常見(jiàn)的2種人上皮細(xì)胞(OKF6/Tert2和FaDu)和2種人內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs和TIME)的異同。介導(dǎo)內(nèi)吞在白念珠菌

7、進(jìn)入FaDu細(xì)胞過(guò)程中起重要作用，但在其進(jìn)入OKF6/Tert2上皮細(xì)胞過(guò)程中，兩種途徑均發(fā)揮重要作用。白念珠菌與HUVECs內(nèi)皮細(xì)胞相互作用早期，主要依靠介導(dǎo)內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞，而在后期則以主要以主動(dòng)入侵方式進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞。白念珠菌進(jìn)入TIME內(nèi)皮細(xì)胞則主要依靠介導(dǎo)內(nèi)吞作用。進(jìn)入方式的差別可能與同種細(xì)胞不同細(xì)胞系的膜表面受體分布、信號(hào)通路以及細(xì)胞骨架（肌動(dòng)蛋白和微管）有關(guān)。最后，我們還比較了白念珠菌毒力蛋白和宿主細(xì)胞因子在白念珠菌介導(dǎo)內(nèi)吞