白念珠菌細胞壁中β(1-3)-葡聚糖通過ERK信號通路激活小鼠樹突狀細胞.pdf

1、研究背景:現(xiàn)代醫(yī)學的進步與科技發(fā)展，在給我們帶來醫(yī)學治療的新手段（如器官移植、腫瘤的放化療、免疫抑制劑的應用增加等）的同時，也引起了一系列的不良事件的發(fā)生，而受害者往往也主要是這些免疫缺陷患者。其中，構成對免疫缺陷宿主威脅最大的3種機會性致病真菌，分別為:煙曲霉、白念珠菌和新生隱球菌。而在這3種機會性致病真菌中，白念珠菌又是最為常見的機會性致病菌，其主要分布于多種組織器官的機會性致病菌，包括口腔、胃腸道、陰道黏膜和皮膚表面等。白念珠菌細

2、胞壁在其致病感染和免疫的過程中具有非常重要的作用。白念珠菌細胞壁的主要成分為多糖，其中含量最多的為葡聚糖。白念珠菌細胞壁的葡聚糖可以通過樹突狀細胞的表面的受體來誘導宿主機體的固有免疫和適應性免疫。樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)是聯(lián)系固有免疫和適應性免疫之間的樞紐，負責感受和監(jiān)測外界環(huán)境，啟動宿主免疫反應并指導適當?shù)目共≡w適應性免疫反應的進行。樹突狀細胞表面的模式識別受體（Pattern recognition r

3、eceptors，PRRs），包括Toll-樣受體、C-型凝集素受體，它們能夠直接識別并結合微生物上高度保守的分子結構（如白念珠菌細胞壁上的葡聚糖等），進而發(fā)揮免疫作用。例如，C-型凝集素受體如Dectin-1通過識別真菌表面的β-葡聚糖，進而識別多種真菌的感染，包括念珠菌、隱球菌、曲霉菌，進而參與細胞內(nèi)的信號轉導。機體通過識別白念珠菌細胞壁及其代謝產(chǎn)物進行不同的免疫反應應答，由于T細胞在免疫應答中處于核心地位，而DC又是目前已知的唯一

4、可以活化的初始輔助性T細胞的專職抗原提呈細胞，因此，研究DC對白念珠菌的抗感染免疫反應就顯得尤為重要。因此本研究初步探討白念珠菌壁中的成分(β(1-3)-葡聚糖）對小鼠樹突狀細胞免疫應答的機制。
　　材料與方法:細胞:小鼠樹突狀細胞DC2.4細胞系;菌株:白念珠菌(ATCC11006)。材料與方法:1.細胞培養(yǎng):1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素、0.25％胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、PBS緩沖液等。2.RNA提取及測定:

5、Trizol裂解液、氯仿、異丙醇、RNAase-free水、ddH2O等。3.總蛋白提取及測定:RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA試劑盒等。4.RT-PCR: GAPDH引物、反轉錄試劑盒、qPCR試劑盒等。5.Western blot:兔抗小鼠GAPDH抗體、兔抗小鼠IL-2、6、8抗體、兔抗小鼠ERK、p-ERK抗體、兔抗小鼠caspase8抗體、兔抗小鼠CDK2抗體、兔抗小鼠cyclin-A抗體、山羊抗兔IgG、SDS-PAGE

6、凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、10×TBST、甘氨酸、Trizma base、SDS等。6.流式細胞術:PBS緩沖液、無水乙醇、PI試劑盒、FITC試劑盒。
　　結果:在β(1-3)-葡聚糖的作用下，DC2.4細胞內(nèi)的促炎因子IL-2、IL-6、IL-8的mRNA表達量增加，且在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著β(1-3)-葡聚糖濃度的增加IL-2、IL-6、IL-8的mRNA表達量也增加，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義

7、(P＜0.05)。且用Western blot的方法檢測在β(1-3)-葡聚糖的作用下DC2.4細胞內(nèi)的IL-2、IL-6、IL-8的蛋白表達水平與mRNA的表達水平結果一致。在β(1-3)-葡聚糖的作用下，細胞S期增加，促進細胞周期進程，且在一定范圍內(nèi)隨著β(1-3)-葡聚糖濃度的增加，細胞S期增加，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。且加入ERK信號通路抑制劑PD98059，發(fā)現(xiàn)其可以逆轉細胞因加入白念珠菌β(1-3)

8、-葡聚糖而引起的S期細胞的增多，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。用Western blot的方法檢測在β(1-3)-葡聚糖和PD98059的作用下DC2.4細胞內(nèi)ERK信號通路關鍵蛋白及其下游周期相關蛋白因子的表達也發(fā)生相應的變化。在β(1-3)-葡聚糖的作用下，DC2.4細胞的凋亡數(shù)量明顯減少，且在一定范圍內(nèi)隨著β(1-3)-葡聚糖濃度的增加，細胞凋亡減少，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。且加入ERK信號通路抑制

9、劑PD98059，發(fā)現(xiàn)其可以逆轉細胞因加入白念珠菌β(1-3)-葡聚糖而引起的抑制細胞凋亡，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。用Western blot的方法檢測在β(1-3)-葡聚糖和PD98059的作用下DC2.4細胞內(nèi)ERK信號通路關鍵蛋白及其下游凋亡相關蛋白因子的表達也發(fā)生相應的變化。
　　結論:白念珠菌細胞壁中β(1-3)-葡聚糖可促進DC2.4細胞炎癥因子IL-2、IL-6、IL-8的表達。白念珠菌細胞壁中β(1-3