HBsAg對(duì)樹突狀細(xì)胞Tim-3信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：
　　1、研究外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞(MD-DCs)體外經(jīng)乙肝表面抗原(HBsAg)刺激后，細(xì)胞表面Tim-3及下游信號(hào)分子NF-kB蛋白表達(dá)變化，以及MD-DCs刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力和下游炎癥因子IL-6、IL-10、IFN-γ分泌水平的變化;
　　2、研究Tim-3單克隆抗體(anti-Tim-3)阻斷Tim-3信號(hào)分子后，MD-DCs對(duì)HBsAg體外刺激免疫應(yīng)答的變化，探討Tim-3信號(hào)分子對(duì)MD

2、-DCs免疫功能的影響。
　　方法：
　　1、收集健康成人外周血，分離純化單核細(xì)胞，于培養(yǎng)基中添加rhGM-CSF、rhIL-4共培養(yǎng)7天，誘導(dǎo)為樹突狀細(xì)胞(MD-DCs)，流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞CD11c、HLA-DR、CD80、CD86表型。
　　2、將MD-DCs細(xì)胞分為4組，分別添加不同濃度的HBsAg(0，1ug/ml、2ug/ml、5ug/ml)共培養(yǎng)48h; Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞Tim-3、NF-

3、κB信號(hào)蛋白表達(dá)水平，MTS法檢測(cè)各組MD-DCs細(xì)胞刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-6、IL-10、IFN-γ濃度。
　　3、同時(shí)設(shè)立阻斷組，預(yù)先在MD-DCs細(xì)胞培養(yǎng)基中加入Tim-3單克隆抗體(anti-Tim-3，10ug/ml)阻斷Tim-3信號(hào)分子，之后添加HBsAg(5ug/ml)共培養(yǎng)48h，同上方法檢測(cè)MD-DCs細(xì)胞信號(hào)蛋白表達(dá)及炎癥因子分泌水平。<

4、br>　　4、采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)分析，結(jié)果用(x)±S表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間結(jié)果的差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.單核細(xì)胞與rhGM-CSF、rhIL-4共培養(yǎng)7天，可見細(xì)胞聚集形成懸浮集落，顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞表面粗糙，邊緣短小毛刺樣突起，呈典型DC形態(tài)。MD-DCs細(xì)胞流式鑒定示DC特異性表面標(biāo)志物表達(dá)

5、CD11c(70.09±0.57)％、HLA-DR(79.83±2.12)％，DC成熟度表面標(biāo)志物表達(dá)率CD80（48.43±7.34）％、CD86（44.21±5.35）％。單核細(xì)胞成功誘導(dǎo)為樹突狀細(xì)胞(MD-DCs)。
　　2、與未添加HBsAg刺激的對(duì)照組相比，+5ug/ml組和+2ug/ml組HBsAg體外刺激MD-DCs細(xì)胞Tim-3（t值分別為6.31、2.28，均p＜0.05）及下游信號(hào)分子NF-κ3（t值分別為6.

6、69、4.27，均p＜0.01）表達(dá)均顯著增高，MD-DCs刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖能力均增強(qiáng)（效靶比1∶5）(t值分別為14.71、7.23，均p＜0.01)，下游炎癥因子IL-6（t值分別為6.61、3.88，均p＜0.01）、IL-10（t值分別為6.41、4.13，均p＜0.01）、IFN-γ（t值分別為13.05、5.77，均p＜0.01）分泌水平均增高;+1ug/ml HBsAg刺激組較對(duì)照組無明顯差異。與1ug/ml H

7、BsAg刺激組及2ug/ml HBsAg刺激組相比，5ug/ml HBsAg刺激后MD-DCs細(xì)胞信號(hào)分子Tim-3（t值分別為6.26、4.22，均p＜0.01）、NF-κB（t值分別為7.40、2.42，均p＜0.05）表達(dá)水平均上調(diào)，MD-DCs刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖能力均增強(qiáng)（效靶比1∶5）（t值分別為9.02、3.01，均p＜0.05），下游炎癥因子IL-6(t值分別為6.21、2.73，均p＜0.05)、IL-10（t值

8、分別為6.97、2.28，均p＜0.05）、IFN-γ(t值分別為12.67、7.27，均p＜0.01)分泌水平均增高。
　　3、與5ug/ml HBsAg刺激組相比，預(yù)先添加anti-Tim-3阻斷組NF-κB表達(dá)水平下降(t=2.61，p＜0.05)，下游炎癥因子IL-6(t=3.99，p＜0.01)、IL-10(t=5.03，p＜0.01)和IFN-γ(t=6.30，p＜0.01)分泌水平下降。
　　結(jié)論：
　　

9、1、健康成人外周血單核細(xì)胞體外環(huán)境下與rhGM-CSF、rhIL-4聯(lián)合培養(yǎng)成功誘導(dǎo)為樹突狀細(xì)胞。
　　2、HBsAg體外刺激MD-DCs可上調(diào)Tim-3及下游信號(hào)分子NF-κB表達(dá)水平，增強(qiáng)MD-DCs刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)下游炎癥因子IL-6、IL-10、IFN-γ的分泌，并與HBsAg刺激濃度呈現(xiàn)相關(guān)性。
　　3、Tim-3信號(hào)蛋白表達(dá)上調(diào)，MD-DCs免疫反應(yīng)增強(qiáng);阻斷Tim-3信號(hào)蛋白，MD-DCs對(duì)H