小鼠樹突狀細(xì)胞亞型cDC和pDC在BCG免疫應(yīng)答中的作用.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是主要由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）引起的一類以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性人獸共患傳染病。TB是一種古老的疾病，在5000余年前的埃及就發(fā)現(xiàn)了該病的存在，自19世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)TB的致病原以來，人類對它們的研究已經(jīng)持續(xù)了一百多年。然而，TB仍是目前世界上最重要的細(xì)菌性傳染病，全球約1/3人口已被TB病原菌感染，每年有約800萬TB新增病例和130萬死亡病例，是

2、人類傳染病中最大的單因素致死疾病和全球主要疾病負(fù)擔(dān)之一。
　　MTB作為胞內(nèi)菌，其引起的慢性傳染多數(shù)處于潛伏感染狀態(tài)，機(jī)體產(chǎn)生的抗菌免疫應(yīng)答決定疾病的發(fā)生和發(fā)展。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，通過提呈抗原觸發(fā)初始T細(xì)胞免疫應(yīng)答并分泌IL-12等細(xì)胞因子的方式在機(jī)體抗TB免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是聯(lián)系天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答的橋梁。然而，DCs是由許多表型和功能不同的亞型組成的高

3、度異質(zhì)性群體，穩(wěn)態(tài)時小鼠脾臟DCs主要包括漿細(xì)胞DC(plasmacytoid DCs，pDCs)和經(jīng)典DC(conventional DC，cDC)，后者又包括CD8+cDC和CD8-cDC等亞型。對不同DC亞型在抗TB免疫應(yīng)答中的具體免疫功能的深入研究將極大促進(jìn)對機(jī)體抗TB應(yīng)答過程的了解。然而，由于DCs數(shù)量稀少以及亞型分選和制備困難等原因，目前對不同DC亞型在機(jī)體抗分枝桿菌免疫應(yīng)答中的作用還所知甚少。
　　本研究在體內(nèi)和體外

4、條件下對小鼠不同亞型樹突狀細(xì)胞在BCG感染過程中的免疫應(yīng)答特性進(jìn)行了分析，并比較了不同DC亞型在BCG體外感染早期的基因表達(dá)譜差異，以期增加對不同DC亞型在機(jī)體抗分枝桿菌免疫應(yīng)答中的作用的了解。
　　1、小鼠骨髓源DC亞型的體外誘導(dǎo)、鑒定及其生物學(xué)特性分析
　　通過小鼠Flt3L蛋白體外誘導(dǎo)骨髓造血干細(xì)胞制備DCs的cDC和pDC亞型，觀察誘導(dǎo)過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，分析其特征性分子標(biāo)志的表達(dá)，并對其活化前后共刺激分子的表達(dá)、

5、細(xì)胞因子表達(dá)譜以及誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的能力等功能特征進(jìn)行分析。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析顯示體外培養(yǎng)9d后CD11c的陽性率可達(dá)60％以上，經(jīng)LPS活化后在光學(xué)顯微鏡下可觀察到典型的樹突狀形態(tài)。誘導(dǎo)后獲得了具備CD11c+CD45RA-和CD11c+CD45RA+表型特征的cDC和pDC亞型，且cDC可進(jìn)一步分為CD24highCD11blow和CD24lowCDbhigh兩個亞型，同時，pDC也特異性表達(dá)mPDCA-1分子標(biāo)志。LPS刺激后

6、兩種DC亞型均顯著上調(diào)CD40、CD80和CD86等共刺激分子以及MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)。經(jīng)不同的TLR激動劑刺激后，cDC和pDC均表達(dá)較高水平的IL-6和TNF-α，且pDC分泌TNF-α的水平顯著高于cDC，但是它們均顯著低于在GM-DC中的表達(dá)水平;cDC和pDC經(jīng)各種TLR激動劑刺激均未表達(dá)IL-10、MCP-1，而GM-DC中這兩種因子的表達(dá)水平較高;pDC經(jīng)CpG刺激后分泌IFN-α的水平顯著高于GM-DC和c

7、DC;此外，三種DC亞型均未明顯表達(dá)IFN-γ細(xì)胞因子。另外，cDC和pDC亞型均具備一定的活化T細(xì)胞并促進(jìn)其分泌IFN-γ和IL-4T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的能力，但是cDC表現(xiàn)出更強(qiáng)的刺激活化能力。以上結(jié)果顯示成功獲得了具備良好生物學(xué)功能的cDC和pDC亞型，為下一步分析其在分枝桿菌免疫應(yīng)答的作用奠定基礎(chǔ)。
　　2、小鼠骨髓源DC亞型在BCG體外感染早期的免疫應(yīng)答特性分析
　　對Flt3L誘導(dǎo)的FL-cDC和FL-pDC亞型在

8、rBCG-GFP體外感染早期的免疫應(yīng)答特性進(jìn)行分析，包括細(xì)胞的感染率、活化成熟、細(xì)胞因子分泌和特異性抗原提呈能力等。通過激光共聚焦顯微鏡可以在小部分cDC和pDC內(nèi)觀察到細(xì)菌，但是大部分細(xì)胞中并沒有細(xì)菌;FCM分析也顯示兩種DC亞型的GFP陽性率較低，說明BCG對它們的感染水平較低。但是大部分FL-cDC和FL-pDC在感染后4h即表達(dá)高水平的CD40、CD80、CD86共刺激分子和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子，且在感染后12 h達(dá)到最

9、高峰。對FL-cDC和FL-pDC培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α含量的分析顯示，在感染后4h，F(xiàn)L-pDC中IL-6和TNF-α的表達(dá)量均顯著高于FL-cDC，且持續(xù)至12h，而FL-cDC中IL-6和TNF-α的表達(dá)量在12h達(dá)到高峰，感染后12h兩種亞型中IL-6和TNF-α的表達(dá)量均開始下降。對BCG相關(guān)抗原Ag85A多肽的體外抗原提呈試驗(yàn)顯示，F(xiàn)L-cDC和FL-pDC亞型均能特異性提呈該多肽，且孵育12h的提呈能力最強(qiáng)，但是F

10、L-pDC的抗原提呈能力在整個過程中均弱于FL-cDC。這些結(jié)果顯示FL-cDC和FL-pDC在體外均可以識別并吞噬BCG，刺激細(xì)胞高度活化，表達(dá)高水平的共刺激分子和MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子，同時分泌大量的IL-6和TNF-α細(xì)胞因子，并具備提呈BCG相關(guān)抗原的能力。
　　3、小鼠脾臟不同DC亞型在機(jī)體抗BCG免疫應(yīng)答中的作用
　　BCG免疫小鼠，對其脾臟pDC和cDC以及CD8+ cDC和CD8-cDC亞型在感染早期

11、的免疫應(yīng)答特性進(jìn)行分析，同時對持續(xù)感染過程中脾臟cDC和pDC胞內(nèi)BCG的生存及細(xì)胞的殺菌機(jī)制進(jìn)行分析。首先分析了BCG免疫初期（48 h內(nèi)）不同脾臟DC亞型的免疫應(yīng)答特性，F(xiàn)CM分析顯示脾臟pDC的感染率顯著高于cDC，且表現(xiàn)出更高的敏感性;免疫24 h內(nèi)CD8+ cDC和CD8-cDC的感染率基本相同，隨后CD8+ cDC的感染率逐漸下降，而CD8-cDC的感染率則逐漸提高。與未免疫對照相比，BCG免疫后pDC、CD8+ cDC和C

12、D8-cDC中CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ類分子陽性的細(xì)胞比例均增加，且在免疫后4h達(dá)到最高峰，隨后下降;進(jìn)一步分析顯示pDC和CD8+ cDC中不僅上述表面分子陽性的細(xì)胞比例增加，這些陽性細(xì)胞表面各分子的表達(dá)強(qiáng)度也增加，而CD8-cDC中相應(yīng)分子的表達(dá)強(qiáng)度并未增加。此外，BCG相關(guān)抗原Ag85A蛋白免疫小鼠后，脾臟cDC和pDC均表現(xiàn)出抗原提呈能力，且在免疫后4h的提呈水平最強(qiáng)，隨后迅速下降，其中cDC比pDC表現(xiàn)出更強(qiáng)的

13、抗原提呈能力。同時，BCG感染早期脾臟cDC相比pDC表達(dá)更高水平的IL-12，而pDC中TNF-α的表達(dá)量更高。在BCG的持續(xù)感染過程中，脾臟pDC和CD8+ cDC的rBCG-GFP陽性率在感染的不同階段逐漸降低至本底水平，而CD8-cDC中的rBCG-GFP陽性率雖然也有下降，但最終穩(wěn)定在約1％的水平。對免疫后不同階段脾臟cDC和pDC胞內(nèi)BCG的CFU計數(shù)也表現(xiàn)出類似的結(jié)果，即pDC胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量逐漸下降，但至免疫后60 d胞內(nèi)仍

14、有細(xì)菌存在;而cDC胞內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量雖然也有下降，但自免疫15d后即基本保持不變，逐漸顯著高于pDC中的細(xì)菌數(shù)量;另外，這些長期存在于胞內(nèi)的細(xì)菌能持續(xù)刺激宿主細(xì)胞高表達(dá)CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ類分子。在此基礎(chǔ)上，對DC可能的殺菌機(jī)制進(jìn)行探討，在免疫后7d脾臟cDC比pDC表現(xiàn)出更高的胞內(nèi)總NO水平，而兩種DC在BCG免疫后均表現(xiàn)出胞內(nèi)LC3-Ⅱ表達(dá)量升高以及GFP-LC3B和RFP-62在胞內(nèi)的聚集，但是pDC比cDC的表

15、達(dá)量更高，且持續(xù)的時間更長，這顯示在cDC和pDC胞內(nèi)發(fā)揮主要?dú)⒕饔玫臋C(jī)制可能各有側(cè)重。
　　4、小鼠骨髓源DC亞型在BCG體外感染早期的基因表達(dá)譜分析
　　通過cDNA表達(dá)譜芯片對小鼠FL-cDC和FL-pDC亞型在BCG感染早期的差異基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，以期從分子水平對兩種DC亞型在抗BCG免疫應(yīng)答的作用進(jìn)行更廣泛的探討。通過體外誘導(dǎo)并分選FL-cDC和FL-pDC，經(jīng)BCG感染4h，通過芯片雜交，分析兩種DC亞型在感

16、染后4h和24 h相對未感染細(xì)胞（分別定義為4c/0c、24c/0c、4p/0p和24p/0p四組數(shù)據(jù)）的基因表達(dá)譜。本研究將P(corr)的值小于或等于0.05且FC大于或等于2的基因定義為上調(diào)差異表達(dá)，將P(corr)的值小于或等于0.05且FC小于或等于-2的基因定義為下調(diào)差異表達(dá)。芯片的分析結(jié)果顯示，4c/0c組的差異表達(dá)基因1974個，其中上調(diào)表達(dá)1305個，下調(diào)表達(dá)669個;24c/0c組的差異表達(dá)基因1402個，其中上調(diào)表

17、達(dá)765個，下調(diào)表達(dá)637個;4p/0p組的差異表達(dá)基因1100個，其中上調(diào)表達(dá)736個，下調(diào)表達(dá)364個;24p/0p組的差異表達(dá)基因1299個，其中上調(diào)表達(dá)873個，下調(diào)表達(dá)426個。通過DAVID在線分析軟件，對這些差異基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)的分子功能(Molecular function)分類分析，顯示其主要與各種物質(zhì)的結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、細(xì)胞因子和趨化因子活性、細(xì)胞因子和趨化因子受體活性等諸多GO條目有關(guān)，

18、且不同組數(shù)據(jù)之間GO條目的種類和富集程度存在著廣泛差異。信號通路(KEGG pathway)分析顯示這些差異基因主要涉及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、粘著連接、TLR信號通路和NLR信號通路以及某些癌癥相關(guān)的信號通路等，其種類和富集程度在不同組數(shù)據(jù)間同樣也存在差異。重點(diǎn)分析了細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示兩種DC亞型在感染早期均有大量的細(xì)胞因子和趨化因子活性相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，但相關(guān)受體多下調(diào)表