樹突狀細胞在母胎免疫耐受中作用機制的初步探討.pdf

1、胎兒對于母體而言是半異己的異體移植物，因此理論上，母體應該對胎兒發(fā)生免疫排斥反應，但通常這種情況并沒有發(fā)生。故而母胎免疫耐受機制，這一直是人們研究的熱點。 樹突狀細胞(Dendritic Cell，DC)是一類專職的抗原提呈細胞，能有效刺激初始T細胞活化、增殖，處于啟動、調控并維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)。此外，DC還在誘導免疫耐受過程中扮演關鍵角色，具有調控免疫應答尤其是免疫耐受的作用，DC主要是通過誘導T細胞無能或低能反應、誘導T

2、細胞凋亡和外周反應性T細胞清除、誘導CD4+CD25+調節(jié)性T細胞產生等機制引起免疫耐受。其作用與DC類型，成熟狀態(tài)有關。有研究表明DC對妊娠子宮局部免疫的調節(jié)作用會直接地影響著母胎之間的相互作用。DC的起源、類型、成熟度、表型及其功能都具有明顯的多樣性和異質性。機體內存在不同類型的DC亞群，這些亞群負責不同的功能。 體內DC均起源于多能干細胞，主要分為髓系DC(myebiod，MDC/ DC1)和淋巴系DC(lymphoid，

3、LDC/PDC/ DC2)。DC有非成熟和成熟兩種。近年來研究發(fā)現人早孕期蛻膜中存在HLA—DR+Linl—(CD3-CD19-CD14-CD56-CD16-) DC，為非成熟型，MDC。雖然正常妊娠后外周血中MDC和PDC的百分率及MDC/DC比率均出現降低，但臍帶血DC絕對數高于妊娠前外周血，MDC百分率仍高于PDC。復發(fā)性自然流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)蛻膜中CD83+DCs高于正常

4、妊娠。提示DC在RSA病因中有一定作用。 CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)是機體以“主動”方式獲得和維持自身免疫耐受的一種重要細胞。最近有學者指出，母胎免疫平衡的建立和維持與CD4+CD25+Treg細胞的免疫抑制功能密切相關。有學者報道CD4+CD25+ Treg細胞在人類妊娠早期顯著升高，一定數量的CD4+CD25+ Treg細胞在維持正常妊娠中發(fā)揮著重要的作用；URSA的發(fā)生

5、與CD4+CD25+ Treg細胞的減少有關；URSA患者在未孕時已存在CD4+CD25+ Treg細胞的異常表達，及免疫功能的紊亂。 對于建立和維持母胎免疫耐受、以及耐受被打破以致流產的機制，目前尚不完全清楚。已有研究表明，母胎界面局部免疫細胞是從外周被募集而來，并非由前體細胞在子宮內膜自我更新而來，而趨化因子及其受體在母胎界面局部免疫細胞的招募和分化過程中起著始動和關鍵作用，參與胚胎種植時母胎界面的免疫反應。已知CD4+CD

6、25+Trg細胞大量表達趨化因子受體CCR4，CCR4與其配體CCL17、CCL22的相互作用，在CD4+CD25+ Treg T細胞的分布和募集中起到重要作用，有研究報道具有免疫耐受作用的DC可以表達CCL17和CCL22。鑒于以上幾點我們推測可能母胎界面的DC是也是通過大量表達趨化因子受體CCR4的配體CCL17和CCL22，優(yōu)先吸引CD4+CD25+ Treg T細胞而維持母胎界面的免疫微環(huán)境。但正常妊娠前后DC是否表達CCL17

7、和CCL22，表達是否存差異?80％不明原因性習慣性流產與免疫紊亂有關，URSA流產患者DC是否表達CCL17和CCL22，與正常妊娠前后表達是否存差異，目前尚未有相關報道。本研究檢測正常早孕、正常未孕和URSA流產蛻膜或子宮內膜DC表達CCL17和CCL22的水平，探討DC在母胎免疫耐受中可能作用機制。母胎免疫耐受機制的闡明不僅對于免疫因素導致的復發(fā)性流產等病理妊娠的診治具有重要意義，對于腫瘤免疫、移植免疫等領域的研究也具有啟發(fā)作用。

8、 研究目的: 1.建立成熟、完善的蛻膜及子宮內膜DC體外培養(yǎng)體系。 2.檢測正常早孕、正常未孕和URSA流產者蛻膜或子宮內膜DC是否表達CCL17、CCL22，分析是否存在表達差異，探討DC在母胎免疫耐受機制中的可能作用以及與URSA的關系。 材料和方法: 1.研究對象 1.1正常早孕組：選擇2008年7月至2009年4月在我院就診的正常早孕、要求人工流產的婦女為正常早孕組(孕周<14周)

9、，年齡27-37歲，既往無自然流產、死胎、死產史，無染色體畸形、內分泌紊亂、生殖道感染病史，均否認自身免疫性疾病史。有正常足月分娩一次或以上。本次妊娠期間無腹痛、陰道流血等先兆流產的表現，B超提示胚胎與孕周相符，見心管搏動。 1.2正常未孕組：選取同期在我院就診，因子宮肌瘤行腹式子宮切除術患者為正常未孕組，且手術時為月經干凈3-7天。年齡35-42歲，既往有妊娠史，無自然流產、死胎、死產史，均排除自身免疫性疾病史。 1.

10、3 URSA流產組：選取同期在我院就診的完全符合URSA診斷標準，就診時為妊娠早期流產(孕周<14周)，B超提示胚胎無心管搏動。年齡27-37歲，曾連續(xù)兩次和兩次以上早孕自然流產(孕周<14周)。 三組均于納入研究前3個月未經任何免疫治療和接種。 2.實驗方法 2.1蛻膜或子宮內膜單個核細胞的分離，體外DC誘導培養(yǎng)及鑒定 無菌狀態(tài)下，正常早孕組于人流取蛻膜，正常未孕組于腹式子宮切除時取子宮內膜，URSA流

11、產組于清宮時取蛻膜，所取標本按Ⅳ型膠原酶/DNA酶Ⅰ消化和密度梯度離心法分離單個核細胞，分離后的單個核細胞用RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10％FBS，2mML—谷氨酰胺，100U/ml青霉素和鏈霉素)懸浮，6孔板貼壁2小時，吸棄未貼壁的細胞，再每孔加入2ml RPMI1640完全培養(yǎng)基和細胞因子GM—CSF、IL—4(終濃度均為20ng/ml)，于第3、5、7天半量換液，同時加入細胞因子GM—CSF、IL—4(終濃度均為20ng/ml

12、)，第10天收集細胞行流式細胞術鑒定細胞及其純度。 2.2三組標本DC CCL17和CCL22表達水平的測定 2.2.1 real—timePCR檢測三組DC CCL17和CCL22mRNA的表達 按上述方法誘導培養(yǎng)DC，于第十天收集三組DC。依照Invitrogen公司提供的操作步驟提取總RNA，由廣州中山達安生物有限公司設計CCL17、CCL22及H—B—ACTIN引物，按Invitrogen公司提供CCL1

13、7和CCL22二步法real—time—PCR試劑盒操作步驟檢測CCL17和CCL22的mRNA水平，實驗重復3次。 2.2.2 ELISA法檢測三組DC上清液中CCL17、CCL22的蛋白表達 按上述方法誘導培養(yǎng)DC，于第十天收集三組DC。再用RPMI1640完全培養(yǎng)基懸浮，細胞密度為2×105，24孔板培養(yǎng)，每孔600μl，培養(yǎng)12h、24h、48h、72h、96h后收集上清液，期間不換液。收集的上清液，—20℃凍存

14、備用。待樣品收集齊后，按Invitrogen公司提供ELISA試劑盒操作步驟檢測DC培養(yǎng)上清液中CCL17、CCL22蛋白水平。每次設2個復孔，重復實驗2次。 實驗結果: 1.蛻膜或子宮內膜單個核細胞分離、體外DC誘導培養(yǎng)及鑒定 對三組分離的單個核細胞進行精確計數，每克蛻膜、子宮內膜獲得單個核細胞約1×106個，經誘導培養(yǎng)，收集的DC約(1-2)×105個。分離的單個核細胞用6孔板貼壁2h后見圓形貼壁細胞，經rh

15、GM—CSF聯合IL—4誘導，倒置顯微鏡觀察顯示：貼壁細胞形成小的集落，逐漸懸浮，第十天形成少許突起，以單個懸浮為主，細胞仍呈現小而圓、表面突起少等未成熟DC的形態(tài)特征，培養(yǎng)過程中夾雜有少許細長梭狀巨噬細胞生長。第十天輕輕吸取懸浮細胞，將細胞懸液依照FITC—HLA—DR，PE—Lin小鼠抗人抗體順序標記，通過孵育等處理后，流式細胞術檢測DC，其純度>80％。 2.三組標本DC CCL17和CCL22的表達 2.1 re

16、al—timePCR檢測三組DC CCL17和CCL22mRNA的表達 于第十天收集三組誘導培養(yǎng)的DC。結果顯示：DC同時轉錄CCL17和CCL22，正常早孕組兩者表達水平均顯著高于正常未孕組(P<0.01)，URSA流產組與正常未孕組比較顯著差異(P>0.05)，但URSA流產組與正常早孕組有顯著差異(P<0.01)。三組標本檢測結果均顯示CCL17轉錄水平高于CCL22。 2.2 ELISA法檢測三組DC上清液中CC

17、L17、CCL22蛋白的表達 于第十天收集三組誘導培養(yǎng)的DC，再經短暫體外培養(yǎng)。結果顯示：正常早孕DC能夠持續(xù)旺盛分泌趨化因子CCL17和CCL22。同一時間點DC分泌的CCL17和CCL22正常早孕組顯著高于正常未孕組和URSA流產組(均P<0.01)，且URSA流產患者較正常未孕明顯高(除72h點P<0.05，其余均P<0.01)。同組間DC分泌的CCL17和CCL22均無統計學差異(均P>0.05)?？傮w上DC分泌CCL1