細(xì)粒棘球蚴致樹突狀細(xì)胞免疫耐受的機制研究.pdf

1、目的：
　　 本研究旨在觀察囊型包蟲病患者(CE)外周血中單個核細(xì)胞(PBMC)表面TLRs及與血清細(xì)胞因子之間的相互關(guān)系，明確哪種模式識別受體(PRRs)參與了CE的慢性感染過程中IL-10的產(chǎn)生，討論包蟲病病人免疫耐受可能的原因；并進(jìn)一步分析在包蟲病患者PBMC衍生的樹突狀細(xì)胞(MoDC)形態(tài)、表型特點及成熟狀態(tài)等，觀察天然免疫細(xì)胞在包蟲病病人中對免疫耐受的影響，從臨床角度驗證并分析包蟲致宿主免疫耐受方面的機制。進(jìn)而再通過體

2、外實驗應(yīng)用包蟲主要抗原刺激DCs后檢測吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)的表達(dá)，研究作為免疫耐受相關(guān)分子的IDO是否參與到了CE慢性感染中，并促進(jìn)了宿主的免疫耐受，進(jìn)一步確定TLRs、DCs與IDO之間有何聯(lián)系，并且評價抗原B(AgB)潛在的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：
　　 課題第一部分：采用實時熒光定量PCR(QRT-PCR)法檢測34例囊型包蟲病患者(cystic echinococcosis，CE組)與22例健康對

3、照者(healthy control，HC組)外周血單核細(xì)胞(PBMC)中TLR2、4mRNA的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參基因；應(yīng)用ELISA方法檢測兩組血清中IFN-γ、IL-12p70、IL-10、IL-4、IL-17A的濃度，并且對TLR2、4的表達(dá)水平間及它們與血清細(xì)胞因子水平間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)分析。
　　 課題第二部分：先分別采用磁珠分選法、貼壁法對正常人PBMC進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用重組人集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人

4、白細(xì)胞介素-4(rhIL-4)誘導(dǎo)獲得MoDCs。倒置顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)與混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)評定獲得的MoDCs質(zhì)量；再根據(jù)所建立的人MoDCs的體外培養(yǎng)方法將CE患者、健康志愿者的PBMC誘導(dǎo)成為MoDCs后采用倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測MoDC表面標(biāo)志物如CD1a、CD80、CD86、HLA-DR的陽性表達(dá)情況，并結(jié)合MLR檢測兩組MoDCs刺激同種異體T淋巴細(xì)胞的增殖能力，說明DCs是否存在表型缺陷與

5、成熟障礙。
　　 課題第三部分：在體外實驗的條件下，獲得C57BL/6小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(BMDCs)，并進(jìn)行鑒定。用15μg/ml rAgB刺激BMDCs24h，采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)法初步檢測有無IDO表達(dá)；其次再分別應(yīng)用15μg/ml rAgB、5mg/ml小鼠囊型包蟲囊液(MHF)、1，000U/ml IFN-γ(陽性對照)刺激C57BL/6小鼠BMDCs，在6h、18h、24h、48h、60h采用QRT-PCR動態(tài)

6、監(jiān)測IDO、IL-10、TLR2、TLR4的mRNA相對表達(dá)情況；并在不同時間點收集各組DCs后應(yīng)用Western blotting方法檢測IDO的蛋白表達(dá)情況。利用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)動態(tài)檢測細(xì)胞上清中色氨酸的濃度以反映IDO的活性。
　　 結(jié)果：
　　 課題第一部分：慢性CE組的TLR2、TLR4的mRNA相對表達(dá)量均比HC組的表達(dá)增高(P<0.05)；血清中細(xì)胞因子IL-10、IL-4、IL-12p

7、70的濃度在CE組中均比在HC組中的濃度高，兩組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但I(xiàn)FN-γ、IL-17A的濃度在兩組中的差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在CE組中，TLR2、TLR4分別與血清IL-10有正相關(guān)；TLR2與血清IL-12p70有相關(guān)性，但相關(guān)性弱。而TLR4則與血清IL-12p70無相關(guān)性。TLR與其它細(xì)胞因子無相關(guān)性，P值均>0.05。
　　 課題第二部分：經(jīng)貼壁培養(yǎng)2 h后的人外周血PBMCs

8、再行誘導(dǎo)可獲得形態(tài)與功能較優(yōu)的DCs，且此法穩(wěn)定、簡便、經(jīng)濟，是一種適于基礎(chǔ)、臨床研究的DCs體外培養(yǎng)方法。根據(jù)所建立的方法誘導(dǎo)出CE組、HC組的MODCs，并在倒置顯微鏡下觀察到CE組MoDCs表面的樹突狀突起較少。與HC組比較，CE組的MoDCs細(xì)胞表面的CD1a、CD80、CD86、HLA-DR表達(dá)降低(P<0.05)。在MLR中，CE患者的MoDCs刺激T細(xì)胞增殖的能力低于HC組(P<0.05)；
　　 課題第三部分：獲

9、得了純度高且形態(tài)典型的DCs。經(jīng)流式細(xì)胞儀的檢測、MLR結(jié)果表明誘導(dǎo)形成的DCs表達(dá)相關(guān)表面標(biāo)志物，且具有刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力。QRT-PCR的結(jié)果顯示，在rAgB-DCs組中，IDO在24h時明顯上調(diào)，而IL-10、TLR2、TLR4均在48h時顯著上調(diào)。在MHF-DCs組中，干預(yù)24h時IDO、IL-10、TLR2、TLR4均可被上調(diào)，并達(dá)到最高值。蛋白檢測中發(fā)現(xiàn)，在rAgB組中，IDO在24h時出現(xiàn)明顯條帶，而從24h到60h，

10、IDO的表達(dá)逐漸減弱。在MHF處理組中，DCs表達(dá)的IDO在48h時具有明顯的條帶。RP-HPLC結(jié)果顯示，在各干預(yù)組處理DCs24h時，以rAgB組中Try的濃度為最低，IFN-γ為其次，MHF組中的Try濃度比rAgB、IFN-γ兩組的都高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)TLR2、TLR4參與了囊型包蟲病的慢性發(fā)生發(fā)展過程，TLR2、TLR4可作為囊性包蟲抗原的受體，與不同抗原成分相

11、互作用，調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答。TLR的表達(dá)參與了細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，使包蟲逃避了宿主的免疫監(jiān)視。在CE的慢性感染中，血清IL-10水平的分泌增高，可能在保護(hù)寄生蟲的生長、在宿主體內(nèi)存活以逃避宿主的免疫殺傷方面發(fā)揮作用，促使機體向Th2型免疫應(yīng)答方向發(fā)展，形成了囊型包蟲的慢性感染。
　　 (2)通過成功誘導(dǎo)人MoDCs，建立了研究DCs與包蟲之間相互關(guān)系的平臺；CE組所誘導(dǎo)的MoDCs形態(tài)不典型，表面標(biāo)志物的表達(dá)降低，說明CE的MoDC

12、s存在受損，成熟發(fā)生障礙及對T細(xì)胞的刺激能力減弱可能是包蟲致免疫耐受的發(fā)病機制之一。
　　 (3)利用體外實驗發(fā)現(xiàn)rAgB、包蟲囊液都可以上調(diào)DCs表面IDO的表達(dá)。在一定時間內(nèi)rAgB上調(diào)IDO表達(dá)的能力強于MHF上調(diào)IDO表達(dá)的能力；IDO與IL-10的mRNA水平分別在不同的時間點可被上調(diào)，并且IL-10mRNA的上調(diào)延遲于IDOmRNA的上調(diào)，說明IDO可通過TLR2、TLR4的上調(diào)并在細(xì)胞因子IL-10的作用下被激活。