RNAi大鼠樹突狀細胞MHC-I誘導小腸移植免疫耐受.pdf

1、本研究旨在通過siRNA 干擾大鼠樹突狀細胞中MHC-I 分子的表達，在同種異體小腸系膜淋巴結組織的刺激下，誘導移植免疫耐受細胞，即CD8+CD28-抑制性T 細胞，并初步探討相關的免疫學機制，為抑制性T 細胞過繼入大鼠同種異體小腸移植體內后的研究奠定基礎。整個實驗為三部分組成，內容如下： 第一部分 大鼠樹突狀細胞的培養(yǎng)與鑒定 目的:建立穩(wěn)定的培養(yǎng)大鼠樹突狀細胞(DC)方法，并通過鑒定；探討大鼠小腸系膜淋巴組織通過同種異

2、體DC 和外周血單核細胞（PBMC）作用后刺激混合淋巴細胞增殖強度，以及腸系膜淋巴組織與DC 作用后MHC 類分子表達變化。 方法:分離培養(yǎng)SD 大鼠DC、PBMC、混合淋巴細胞，獲取Winstar 大鼠腸系膜淋巴結組織懸液。CCK-8 檢測法測定負載腸系膜淋巴組織抗原的DC 和PBMC，及負載腸系膜淋巴組織抗原和卵白蛋白（OVA）抗原的DC 對混合淋巴細胞刺激增殖能力；流式細胞儀分析腸系膜淋巴組織作用于DC 后，其MHC 類分

3、子表達變化。 結果:DC 培養(yǎng)至12 天時，OX62、CD86、CD80、MHC-I、MHC-II 抗原陽性率分別是80.12％、82.30％、78.14％、83.92％、76.73％,并通過透射電鏡鑒定。獲得的大鼠小腸淋巴組織懸液中，淋巴細胞占91％，其余包括少量粒細胞、漿細胞、上皮細胞等；在各組中負載腸系膜淋巴組織抗原的DC 對混合淋巴細胞刺激增殖能力，均強于PBMC（P<0.05）；在DC 與混合淋巴細胞比例≥1∶100

4、各組中，負載腸系膜淋巴組織抗原的DC，對混合淋巴細胞刺激增殖能力，強于負載OVA 抗原的DC（P<0.05）；腸系膜淋巴細胞組織刺激DC 后，其MHC-I和II 類分子表達高于未加入抗原組。 結論:通過對大鼠骨髓干細胞的誘導分化，能成功的培養(yǎng)出DC； DC 抗原呈遞作用強于單核細胞；小腸系膜淋巴組織具有強抗原性；負載腸系膜淋巴組織抗原后的DC 高表達MHC-I、II 類分子。 第二部分 siRNA干擾大鼠樹突狀細胞MHC

5、-I類分子表達 目的:選擇出最佳siRNA 干擾序列，抑制DC 中MHC-I 類分子的表達；探討抑制MHC-I 類分子的DC 中IL-12、TNF-α和IL-6 表達的改變情況。 方法:應用轉染熒光標記siRNA，在10-200nM 濃度范圍內，結合細胞死亡率與轉染率，檢測最佳siRNA 轉染濃度；在最佳干擾濃度時，通過流式細胞儀與rt-PCR 定量分析方法，對空白對照組、siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRN

6、A-3 組和siRNA-4 組檢測，選擇出最有效抑制DC 中MHC-I 類分子表達的siRNA 序列；設立空白對照組、加入rrIL-10 對照組和有效干擾MHC-I表達的DC 組，應用ELISA 方法比較各組中IL-12、TNF-α表達量,用rt-PCR方法比較各組IL-6 表達量。 結果:濃度為140 nM 時轉染率89.1％，細胞存活率為88.9％，確定此濃度為最佳siRNA 轉染濃度；流式細胞儀檢測分析，siRNA-2 組

7、中MHC-I 的表達量平均值最低，siRNA-2 組與空白對照組、siRNA-1 組、siRNA-3 組和siRNA-4 組中MHC-I 的表達量比較均存在統(tǒng)計學差異（P<0.01）；rt-PCR 檢測siRNA-2 組MHC-I 表達量最低，siRNA-2組與siRNA-1 組、siRNA-3 組比較存在差異（P<0.05）；siRNA-2 組與siRNA-4組、空白對照組比較（P<0.001）統(tǒng)計學上有顯著差異； IL-12 與TN

8、F-α在空白對照組表達量明顯高于IL-10 組和siRNA 干擾組, 統(tǒng)計學差異有顯著性（P<0.01），而IL-10 組和siRNA 組表達量無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)； IL-6在空白對照組的表達量明顯低于siRNA 干擾組與IL-10 組（P<0.01）；siRNA組與IL-10 組比較，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 結論:轉染DC 的最佳濃度為140nM；最有效抑制DC 中MHC-I 表達的序列是siRNA-2 組；

9、在抑制MHC-I表達的DC 細胞中，IL-12 與TNF-α表達量降低，IL-6 表達量升高，并與加入rrIL-10 因子培養(yǎng)組的表達量無統(tǒng)計學差異。 第三部分 RNA 干擾DC MHC-I 表達后誘導CD8+CD28-抑制性T 細胞 目的:通過siRNA干擾DC MHC-I表達后誘導CD8+CD28-抑制性T細胞（Ts）;探討Ts免疫學特性及Ts細胞中TGF-β、IFN-γ和CD25(IL-2R)表達量改變。

10、方法:Winstar大鼠腸系膜淋巴結組織液刺激siRNA干擾MHC-I表達的DC后，同磁珠法分離獲得SD大鼠CD8+T細胞共同培養(yǎng)反應，再次通過磁珠法分離出CD8+CD28-抑制性T細胞；負載Winstar大鼠腸系膜淋巴組織抗原后，分別加入SD大鼠Ts細胞和SD大鼠混合T8細胞后，與SD大鼠混合淋巴細胞反應、負載腸系膜淋巴組織抗原和卵白蛋白（OVA）抗原的Ts與混合淋巴細胞反應以及rrIL-2與同種異體抗原存在或不存在時，Ts細胞在混合

11、淋巴細胞反應中特性變化，均以CCK-8檢測法測定細胞增殖情況；設定CD8+CD28-T細胞組、CD8+CD28+T細胞組和混合T細胞組，應用RT-PCR方法檢測TGF-β、IFN-γ表達，流式細胞儀檢測CD25(IL-2R)表達。 結果:磁珠法分離獲取SD大鼠脾臟中的CD8+T細胞，純度為92.33％；誘導獲得CD8+CD28-T細胞純度85.03％；CD8+CD28-T細胞組和T8混合淋巴細胞組進行MLR后比較，除總細胞數(shù)與T

12、s細胞或對照T8細胞數(shù)比例10：1外, 各組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），T8混合淋巴細胞組細胞增殖能力明顯強于Ts組，隨著Ts細胞數(shù)的增多，抑制混合淋巴細胞增殖作用增強，隨著T8混合淋巴細胞的增多，促混合淋巴細胞增殖能力增強； Ts細胞與腸系膜淋巴細胞組、OVA組反應并進行MLR，總細胞數(shù)與Ts細胞數(shù)比例為1：1和2.5：1時，OVA組增殖量高于腸系膜淋巴細胞組（P<0.05），在5：1和10：1時，OVA組增殖量顯著高于腸系膜

13、淋巴細胞組（P<0.01）；聯(lián)合Winstar大鼠腸系膜淋巴組織細胞液或單獨應用rrIL-2因子，刺激SD大鼠Ts細胞和脾臟細胞混合細胞，細胞增殖反應無差異(P>0.05)；CD8+CD28-Ts細胞組較CD8+CD28+T細胞組、混合T細胞組，TGF-β、IFN-γ表達量升高(P<0.05)，IL-2R表達量明顯降低(P<0.05)。 結論:siRNA干擾DC中MHC-I表達能誘導出CD8+CD28-抑制性T細胞；Ts細胞能誘