hIL-10基因修飾樹突狀細胞誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受的實驗研究.pdf

1、目的: 建立體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)和擴增DA(DarkAgouti)大鼠骨髓來源的樹突狀細胞的方法；建立改良的大鼠原位肝移植模型和急性排斥反應(yīng)模型，用hLK-10基因修飾大鼠骨髓來源的不成熟樹突狀細胞(imDC)；探討其誘導(dǎo)同種異體大鼠原位肝移植免疫耐受的情況。 方法: 1.培養(yǎng)、誘導(dǎo)和擴增DA大鼠骨髓來源的DC，經(jīng)形態(tài)學、免疫表型及功能鑒定后，將pIRES2-EGFP-hIL-10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染imDC，檢測hIL-10在i

2、mDC中的表達。 2.建立改良的大鼠原位肝移植模型和DA大鼠→Lewis大鼠急性排斥反應(yīng)模型：在原二袖套法的基礎(chǔ)上，采用快速切取供肝，一針法連續(xù)縫合肝上下腔靜脈以及對出血點進行熱止血等方法，進行120例大鼠原位肝移植，并觀察術(shù)后存活率。 3.行以DA大鼠為供體、近交系Lewis大鼠為受體的同種異體原位肝移植100例，隨機均分為5組：未注射DC組(對照組)、mDC組、imDC組、空載體組、及hIL-10轉(zhuǎn)染組；分別于移植前

3、5d每天給Lewis大鼠腹腔注射mDC、imDC、空載體轉(zhuǎn)染的imDC和hIL-10修飾的imDC各2x106個，于肝移植術(shù)后3d、7d、10d各處死4只，觀察外周血肝功能變化(ALT和TBIL)，肝臟病理改變，外周血清細胞因子情況，各組除去技術(shù)死亡的受鼠，將余下受鼠作生存分析，死亡時取肝臟行病理組織學檢查。 結(jié)果: 1.成功建立了體外大量培養(yǎng)、誘導(dǎo)及擴增大鼠骨髓來源DC的方法；經(jīng)倒置相差顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡及流式

4、細胞儀鑒定，證實所培養(yǎng)細胞為DC。形態(tài)學結(jié)果顯示：DC形態(tài)不規(guī)則，細胞核大而偏位，細胞表面可見細長樹枝狀突起。免疫表型結(jié)果顯示：mDC和imDC表面均表達表面分子OX62，而共刺激分子CD86在mDC呈高表達，在imDC呈低表達?；旌狭馨图毎磻?yīng)(MLR)結(jié)果顯示：imDC刺激同種異體T淋巴細胞的能力明顯弱于mDC(P=0.005)。plRES2-EGFP-hIL-10質(zhì)粒經(jīng)基因測序顯示其序列與Pubmed基因庫的hIL-10序列相符合

5、；經(jīng)PCR鑒定示在540bp處有明顯的條帶。熒光顯微鏡觀察顯示plRES2-EGFP-hlL-10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染imDC后可見黃綠色熒光。流式細胞術(shù)顯示轉(zhuǎn)染后DC表面分子CD86和CD80的表達未受影響。轉(zhuǎn)染后MLR顯示，hlL-10轉(zhuǎn)染組的imDC對T細胞的增殖反應(yīng)均弱于imDC組和空載體組(P=0.024和P=0.033)。ELISA檢測IL-10組的hIL-10表達明顯高于mDC組、imDC組及空載體組(P=0.004、0.004及0.

6、003)；經(jīng)Westen-Blot檢測有hlL-10蛋白表達。 2.成功建立改良的大鼠原位肝移植模型和急性排斥反應(yīng)模型。 3.活體觀察：移植后的肝臟病理組織學切片顯示IL-10組術(shù)后僅有較少量的單核細胞浸潤，RAI評分2～5分，屬非確定型急性排斥反應(yīng)到輕度急性排斥反應(yīng)，10d開始出現(xiàn)肝細胞再生，有少量的中性粒細胞浸潤。肝功能示IL-10組在7d、10d時，肝功能有所恢復(fù)，但與imDC組及空載體組相比差異無統(tǒng)計學意義。EL

7、ISA檢測示，術(shù)后7d，IL-10組的血清IL-12濃度均低于對照組、mDC組、imDC組及空載體組(P為0.000、0.000、0.005及0.008)。IL-10組中位生存期40d均長于imDC組(23d)和空載體組(25d)(P均為0.002)。 結(jié)論: 1.本實驗通過運用大鼠淋巴細胞分離液和培養(yǎng)過程的手法篩選相結(jié)合，能培養(yǎng)、誘導(dǎo)、擴增大量的DC；hIL-10基因轉(zhuǎn)染imDC能夠獲得有效的表達，轉(zhuǎn)染后對imDC表型