γδTreg誘導(dǎo)免疫耐受性樹突狀細(xì)胞在移植物抗宿主病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)是治療惡性血液系統(tǒng)疾病的有效手段，急性移植物抗宿主病(aGVHD)成為阻礙移植成功的關(guān)鍵因素之一。目前aGVHD的最主要預(yù)防和治療手段為免疫抑制藥物，但容易導(dǎo)致移植后感染風(fēng)險(xiǎn)增加;體內(nèi)外去除T細(xì)胞是另一種常用的策略，但也伴隨著植入失敗、移植后復(fù)發(fā)率增高等風(fēng)險(xiǎn)。近年來越來越多的免疫細(xì)胞亞群被發(fā)現(xiàn)在aGVHD調(diào)控中起重要作用，過繼免疫細(xì)胞輸注調(diào)控aGVHD具有較好的臨床應(yīng)用前景。<

2、br>　　調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞(γδTreg)是新發(fā)現(xiàn)的γδT細(xì)胞亞群，該細(xì)胞亞群具有與Foxp3+αβTreg細(xì)胞相似的生物學(xué)特性，發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控功能。我們前期建立了高效的γδTreg體外誘導(dǎo)擴(kuò)增富集體系，并發(fā)現(xiàn)該群細(xì)胞能負(fù)向調(diào)控小鼠allo-HSCT后aGVHD但不影響GVL效應(yīng)，但機(jī)制尚未完全明確。通過細(xì)胞間接觸的方式抑制T細(xì)胞的增殖活化是其中的機(jī)制之一。進(jìn)一步闡明γδTreg負(fù)向調(diào)控aGVHD的完整機(jī)制將為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

3、r>　　抗原提呈細(xì)胞樹突狀細(xì)胞(DC)在aGVHD發(fā)生發(fā)展的病理生理過程中起重要作用。DC在預(yù)處理后活化，活化后的DC處理并遞呈宿主抗原給供者來源的T細(xì)胞，并進(jìn)一步通過共刺激分子信號(hào)使得T細(xì)胞活化和增殖，這是aGVHD起始階段的關(guān)鍵事件。近年來通過誘導(dǎo)免疫耐受性DC的生成是aGVHD治療中重要的研究方向。αβTreg與免疫耐受性DC之間有互相誘導(dǎo)生成的作用，兩者共同參與維持移植后的免疫耐受。因此，我們推測(cè)γδTreg誘導(dǎo)免疫耐受性DC的

4、生成是其發(fā)揮負(fù)向調(diào)控aGVHD的機(jī)制之一。在本研究的前兩部分，我們首先在體外研究了γδTreg誘導(dǎo)免疫耐受性DC的生成，包括對(duì)DC成熟、吞噬、刺激活化T細(xì)胞、黏附、遷移等功能影響，并探討了可能的機(jī)制;進(jìn)一步在人源化小鼠aGVHD模型體內(nèi)環(huán)境中驗(yàn)證了γδTreg誘導(dǎo)免疫耐受性DC是其發(fā)揮負(fù)向調(diào)控aGVHD作用的機(jī)制之一。
　　另一方面，目前關(guān)于Foxp3+γδTreg的研究都是采用富集了γδTreg的γδT混合細(xì)胞，但這不能完整反映

5、Foxp3+γδTreg的真實(shí)生物學(xué)功能。目前尚未發(fā)現(xiàn)Foxp3+γδTreg與Foxp3-γδT之間具有差異表達(dá)的膜蛋白可供分選純化，這也大大限制了對(duì)Foxp3+γδTreg的生物學(xué)功能的進(jìn)一步研究和相應(yīng)的臨床應(yīng)用。因此，本研究的第三部分通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)探索了Foxp3+γδTreg與Foxp3-γδT的轉(zhuǎn)錄組差異，為尋找兩者之間差異表達(dá)的膜蛋白從而進(jìn)一步能純化分離Foxp3+γδTreg提供新的思路。
　　具體研究?jī)?nèi)容

6、分為3部分:
　　1)γδTreg細(xì)胞體外誘導(dǎo)免疫耐受性DC生成的作用及機(jī)制研究;2）γδTreg細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)免疫耐受性DC的生成發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控aGVHD的作用;3）γδTreg細(xì)胞表面特異性分子標(biāo)記的篩選和純化。
　　第一章γδTreg細(xì)胞體外誘導(dǎo)免疫耐受性DC生成的作用及機(jī)制研究
　　目的:
　　研究γδTreg體外誘導(dǎo)免疫耐受性DC生成的作用，包括對(duì)DC成熟、吞噬、遷移、黏附、活化T細(xì)胞等功能的負(fù)向免疫調(diào)

7、控作用，并闡明相應(yīng)的機(jī)制。
　　方法:
　　從健康成年人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，分別進(jìn)行DC和γδTreg的誘導(dǎo)培養(yǎng)。γδTreg與iDC或mDC共培養(yǎng)48h后磁珠分選去除γδTreg，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)共刺激分子熒光強(qiáng)度，采用FITC-Dextran的胞吞實(shí)驗(yàn)，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附實(shí)驗(yàn)，Transwell下趨化因子的遷移實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)DC吞噬、黏附、遷移等功能，并在共培養(yǎng)過程中加用Transwell

8、或阻斷抗體來進(jìn)一步闡明γδTreg誘導(dǎo)免疫耐受性DC生成的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　γδTreg與iDC共培養(yǎng)后能顯著抑制LPS促進(jìn)的iDC成熟，CD80、CD86、CD40、HLA-DR表達(dá)水平顯著下調(diào)，該抑制作用依賴于ICOS/ICOSL的結(jié)合，同時(shí)還能顯著抑制iDC的吞噬功能。γδTreg與mDC共培養(yǎng)后能顯著抑制mDC的黏附功能，以及向CXCL12的遷移功能，相應(yīng)的CXCR4表達(dá)下調(diào)，而對(duì)CCR7無影響，對(duì)黏附功能的抑

9、制同樣依賴于ICOS/ICOSL的結(jié)合。與γδTreg共培養(yǎng)后iDC和mDC刺激活化T細(xì)胞的能力均顯著降低。
　　結(jié)論:
　　γδTreg體外可通過抑制DC成熟、吞噬、遷移、黏附、活化T細(xì)胞等功能誘導(dǎo)免疫耐受性DC的作用，γδTreg對(duì)DC的負(fù)向免疫調(diào)控功能部分依賴于ICOS/ICOSL的結(jié)合。
　　第二章γδTreg細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)免疫耐受性DC的生成發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控aGVHD的作用
　　目的:
　　在第一章

10、中我們?cè)隗w外已經(jīng)明確了γδTreg可誘導(dǎo)免疫耐受性DC的生成，本章通過構(gòu)建人源化小鼠aGVHD模型驗(yàn)證γδTreg在aGVHD體內(nèi)環(huán)境下對(duì)DC的調(diào)控作用。
　　方法:
　　采用NOG小鼠輻照后回輸PHA活化的hPBMCs與體外培養(yǎng)的iDC構(gòu)建人源化小鼠aGVHD模型，其中一組同時(shí)回輸γδTreg細(xì)胞，比較兩組小鼠的aGVHD癥狀、生存時(shí)間、aGVHD靶器官損傷;移植后第7天檢測(cè)比較兩組小鼠人細(xì)胞的嵌合程度，以及脾臟、外周血中

11、DC共刺激分子表達(dá)水平、DC的黏附遷移能力。
　　結(jié)果:
　　1）小鼠異體移植模型中，aGVHD組的DC共刺激分子水平顯著高于無aGVHD組;
　　2）γδTreg對(duì)人源化小鼠aGVHD模型具有保護(hù)作用，小鼠aGVHD癥狀減輕，生存時(shí)間延長(zhǎng)，靶器官損傷小;
　　3）γδTreg對(duì)小鼠aGVHD體內(nèi)環(huán)境中外周血、脾臟的人DC免疫調(diào)控功能不同。γδTreg顯著下調(diào)外周血人DC的共刺激分子表達(dá)水平，但對(duì)脾臟中人DC的共

12、刺激分子抑制作用不明顯;相反，γδTreg能顯著抑制脾臟中人DC的遷移黏附功能，但對(duì)外周血中人DC的黏附遷移功能無顯著影響。
　　結(jié)論:
　　γδTreg對(duì)人源化小鼠aGVHD模型具有保護(hù)作用。γδTreg在aGVHD體內(nèi)環(huán)境下可誘導(dǎo)免疫耐受性DC的生成，但對(duì)外周血和脾臟DC的調(diào)控功能不同。γδTreg誘導(dǎo)免疫耐受性DC是其發(fā)揮負(fù)向調(diào)控aGVHD作用的機(jī)制之一。
　　第三章γδTreg細(xì)胞表面特異性分子標(biāo)記的篩選和純化

13、
　　目的:
　　探索比較Foxp3+γδTreg與Foxp3-γδT之間的轉(zhuǎn)錄組差異，篩選Foxp3+γδTreg表面特異性分子標(biāo)記。
　　方法:
　　采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)常見的可能分子標(biāo)記在Foxp3+γδTreg與Foxp3-γδT兩群細(xì)胞中的表達(dá);采用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在單細(xì)胞水平比較Foxp3+γδTreg與Foxp3-γδT的轉(zhuǎn)錄組差異，多種策略對(duì)比篩選出在兩群細(xì)胞間差異表達(dá)基因，并通過蛋白定位數(shù)據(jù)庫篩選

14、出其中定位于膜的蛋白基因，進(jìn)一步通過高通量單細(xì)胞qPCR驗(yàn)證篩選。
　　結(jié)果:
　　常見的可能分子標(biāo)記CD127、CD45RA、 CD49d、 CTLA-4、GITR、ICOS、CD27、CD69在Foxp3+γδTreg與Foxp3-γδT兩群細(xì)胞中均未見顯著差異表達(dá)，不能用于Foxp3+γδTreg的純化分選;Foxp3在誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中是不穩(wěn)定表達(dá)的，誘導(dǎo)培養(yǎng)早期迅速增高，高峰期維持約15天，40天左右小于5％，但Fox

15、p3+比例小于5％時(shí)細(xì)胞狀態(tài)差，難以用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較分析;單細(xì)胞水平Foxp3mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)連續(xù)分布，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)Ρ群Y選出278差異表達(dá)基因，通過蛋白定位數(shù)據(jù)庫篩出膜蛋白差異表達(dá)基因35個(gè)，進(jìn)一步通過高通量單細(xì)胞qPCR驗(yàn)證篩選出8個(gè)可能在兩群細(xì)胞間差異表達(dá)的分子標(biāo)記。
　　結(jié)論:
　　我們首次通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在單細(xì)胞水平揭示了Foxp3+γδTreg與Foxp3-γδT細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組差異，并通過篩選驗(yàn)證獲得