調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞在急性移植物抗宿主病中的作用及機(jī)理研究.pdf

1、目的：
　　為了探討γδTreg在aGVHD中的作用及發(fā)病機(jī)理，本研究比較了allo-HSCT后aGVHD患者發(fā)病時(shí)和配對(duì)未發(fā)生aGVHD的患者，以及移植后aGVHD患者不同疾病狀態(tài)時(shí)（aGVHD發(fā)病、疾病好轉(zhuǎn)和進(jìn)展）外周血γδTreg細(xì)胞功能亞群的表達(dá)及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)這兩個(gè)方面來(lái)研究γδTreg在aGVHD的作用和發(fā)病機(jī)理。
　　方法：
　　1.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)allo-HSCT后24例aGVHD患者發(fā)病時(shí)與

2、24例未發(fā)生aGVHD的配對(duì)患者（同期基本資料相匹配）外周血γδTreg細(xì)胞功能亞群(總γδ T細(xì)胞、Vδ1、Vδ2、Foxp3+γδ T、Foxp3+Vδ1、Foxp3+Vδ2、CD25+γδ、CD25+Vδ1、CD25+Vδ2、 CD27+γδ、CD27+ Vδ1、 CD27+ Vδ2)和CD4+CD25+Foxp3+(Treg)的表達(dá)比例，并結(jié)合臨床資料觀察外周血γδTreg細(xì)胞功能亞群表達(dá)與移植后aGVHD的關(guān)系。
　　2

3、.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)aGVHD患者不同疾病狀態(tài)時(shí)（aGVHD發(fā)病、疾病好轉(zhuǎn)和進(jìn)展）外周血γδ Treg細(xì)胞功能亞群（總γδ T細(xì)胞、Vδ1、Vδ2、Foxp3+γδ T、Foxp3+Vδ1、Foxp3+Vδ2、 CD25+γδ、CD25+ Vδ1、CD25+ Vδ2、CD27+γδ、CD27+ Vδ1、 CD27+ Vδ2)和Treg表達(dá)比例，并結(jié)合臨床資料觀察外周血γδ Treg細(xì)胞功能亞群表達(dá)與移植后GVHD發(fā)生的關(guān)系。
　　

4、3.采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription polymerasechain reaction，RT-PCR)檢測(cè)allo-HSCT后24例aGVHD患者發(fā)病時(shí)與24例未發(fā)生aGVHD的配對(duì)患者（同期基本資料相匹配）外周血γδ Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子（Foxp3、CD25、RORc、CTLA4、GATA3、GITR、IL-17A、IL-23R、STAT1、STAT3、T-bet、TLR8）的表達(dá)

5、水平。
　　4.采用RT-PCR檢測(cè)aGVHD患者不同疾病狀態(tài)時(shí)（aGVHD發(fā)病、疾病好轉(zhuǎn)和進(jìn)展）外周血γδ Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子(Foxp3、CD25、RORc、CTLA4、GATA3、GITR、IL-17A、IL-23R、STAT1、STAT3、T-bet、TLR8)的表達(dá)水平。
　　5.蛋白液相芯片技術(shù)檢測(cè)allo-HSCT后24例aGVHD患者發(fā)病時(shí)與24例未發(fā)生aGVHD的配對(duì)患者（同期基本資料相匹配）血清

6、中細(xì)胞因子干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）、白介素-10（Interleukin-10，IL-10）、白介素-17A(Interleukin-17，IL-17A)、白介素-4（Interleukin-4，IL-4）、腫瘤壞死因子-α（Tumour necrosis factor-α，TNF-α）水平，分析aGVHD患者外周血中γδTreg對(duì)aGVHD轉(zhuǎn)歸的影響。
　　6.蛋白液相芯片技術(shù)檢測(cè)aGVHD患者不同疾病

7、狀態(tài)時(shí)（aGVHD發(fā)病、疾病好轉(zhuǎn)和進(jìn)展）血清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10、IL-17A、IL-4和TNF-α水平，分析aGVHD患者外周血中γδTreg對(duì)aGVHD轉(zhuǎn)歸的影響。
　　結(jié)果：
　　1、24對(duì)患者流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)果示:配對(duì)未發(fā)生aGVHD患者外周血總γδ T細(xì)胞、Vδ2細(xì)胞亞群比例顯著高于aGVHD發(fā)病患者(t=-2.244，t=-5.640; P=0.044，P=0.000)，而Vδ1細(xì)胞亞群比例無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)（t=-2.066，P=0.061）。同一間期內(nèi)，配對(duì)未發(fā)生aGVHD患者外周血Foxp3+γδ T、Foxp3+Vδ1、Foxp3+Vδ2、CD27+γδ T、CD27+ Vδ1 T和Treg細(xì)胞亞群比例顯著高于aGVHD發(fā)病患者(t=-3.453,t=-2.862,t=-2.548,t=-3.116,t=-2.778,t=-5.088; P=0.005,P=0.014,P=0.026，P=0.009，P=0.018，P=0.000

9、)。兩組患者外周血CD25+γδ T、CD25+ Vδ1、CD25+ Vδ2和CD27+ Vδ2細(xì)胞亞群比例無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=-0.722，t=-1.516，t=-0.202,t=-1.613; P=-0.484,P=0.155,P=0.844,P=0.120）。外周血Foxp3+γδ T、Foxp3+Vδ1和Foxp3+Vδ2亞群表達(dá)比例下降與移植后aGVHD發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)(P=0.014,rs=-0.477; P=0.001,r

10、s=-0.610; P=0.040,rs=-0.405)。
　　2、24對(duì)患者RT-PCR檢測(cè)結(jié)果示:配對(duì)未發(fā)生aGVHD患者外周血Foxp3、T-bet、TLR8基因mRNA表達(dá)水平顯著高于發(fā)生aGVHD患者（t=2.169，t=2.551，t=3.583; P=0.042，P=0.019，P=0.002）;兩組患者CD25、RORc、CTLA4、GATA3、GITR、IL-17A、IL-23R、STAT1、STAT3基因mRN

11、A表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.244,t=1.340,t=-2.026,t=-1.406,t=-0.650,t=1.877,t=-0.443,t=1.528,t=-0.290;P=0.234, P=0.194, P=0.056,P=0.174,P=0.524, P=0.073, P=0.663, P=0.142,P=0.775)。
　　3、aGVHD患者發(fā)病時(shí)IL-10濃度和TNF-α濃度顯著高于配對(duì)未發(fā)生aGVHD患者（t=-

12、2.512，t=-2.229; P=0.002，P=0.036）;兩組間IFN-γ、 IL-4、IL-17A均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.898，t=-0.833，t=-1.417; P=0.379，P=0.414，P=0.170)。
　　4、15例aGVHD患者中12例患者經(jīng)甲潑尼龍和環(huán)孢素治療2周有效（包括完全緩解(CR)8例，部分緩解(PR)4例）和3例患者治療無(wú)效病情進(jìn)展，通過(guò)研究我們發(fā)現(xiàn):aGVHD患者發(fā)病時(shí)Foxp3+γ

13、δ T、Foxp3+Vδ1、Foxp3+Vδ2、CD25+γδ T和CD25+ Vδ1明顯低于緩解時(shí)(P=0.023，P=0.008，P=0.028，P=0.008，P=0.028);而γδ T、Vδ1、Vδ2、CD27+γδ T、 CD27+ Vδ1、CD27+ Vδ2、CD25+Vδ2和Treg細(xì)胞亞群的變化無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.308，P=0.117，P=0.099，P=0.182，P=0.084，P=0.530，P=0.20

14、9，P=0.066)。同時(shí)我們也對(duì)3例經(jīng)甲潑尼龍和環(huán)孢素治療2周無(wú)效病情進(jìn)展的患者外周血γδ T細(xì)胞功能亞群變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)aGVHD進(jìn)展時(shí)Foxp3+γδ T、CD27+γδ T和CD25+ Vδ1細(xì)胞亞群表達(dá)量有明顯的下降趨勢(shì)，而γδ T、Vδ1、Vδ2、CD25+γδ T、CD27+ Vδ1、CD27+ Vδ2、CD25+ Vδ2和Treg細(xì)胞亞群未發(fā)現(xiàn)明顯的變化趨勢(shì)。
　　5、aGVHD患者發(fā)病時(shí)Foxp3、T-bet

15、、RORc、TLR8基因的表達(dá)水平明顯低于病情好轉(zhuǎn)時(shí)(P=0.041，P=0.030，P=0.019，P=0.035)。而CD25、CTLA4、GATA3、GITR、IL-17A、IL-23R、STAT-1、STAT-3基因的表達(dá)水平無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.95, P=421, P=0.051, P=0.605, P=0.911, P=0.547, P=0.186,P=0.809)。aGVHD患者治療無(wú)效病情進(jìn)展的患者，F(xiàn)oxp3基因

16、mRNA的相對(duì)表達(dá)水平與aGVHD發(fā)病患者相比有進(jìn)一步下降的趨勢(shì)。
　　6、我們發(fā)現(xiàn)aGVHD患者發(fā)病時(shí)IL-10濃度顯著高于aGVHD患者好轉(zhuǎn)時(shí)(P=0.002);而兩組患者的IFN-γ、IL-17A、IL-4、TNF-α的濃度無(wú)明顯變化(P=0.602，P=0.152，P=0.314，P=0.254)。aGVHD患者經(jīng)治療無(wú)效病情進(jìn)展時(shí)，IL-10濃度和aGVHD發(fā)病時(shí)相比有明顯升高趨勢(shì);而IFN-γ、 IL-4、IL-17A

17、、和TNF-α濃度無(wú)明顯的變化趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　1.與同期未發(fā)生aGVHD配對(duì)患者相比，aGVHD患者發(fā)病時(shí)外周血Foxp3+γδ T、Foxp3+Vδ1、Foxp3+Vδ2、CD27+Foxp3+Vδ1亞群比例均顯著降低。外周血Foxp3+γδ T、Foxp3+Vδ1和Foxp3+Vδ2亞群表達(dá)比例下降與移植后aGVHD發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)。
　　2.aGVHD患者發(fā)病時(shí)Foxp3+γδ T、Foxp3+Vδ1和Fo