急性移植物抗宿主病對骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞數(shù)量的影響及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)(allogenenic hematopoieticstem cell transplantation，allo-HSCT)是治療許多血液系統(tǒng)惡性疾病最有效的方法，急性移植物抗宿主病(acute graft versus host diseause，aGVHD)是影響造血干細(xì)胞移植患者生存和生活質(zhì)量的重要原因，其病理生理機(jī)制為植入的供體T淋巴細(xì)胞被宿主抗原致敏而激活、增殖分化，直接或間接導(dǎo)致靶

2、器官(皮膚、肝、小腸、肺)的損害。除已知的aGVHD靶器官損害之外，aGVHD的患者常伴有供體來源的造血干細(xì)胞功能障礙，對造血生長因子等治療反應(yīng)不佳，嚴(yán)重影響造血干細(xì)胞移植患者的生存、生活質(zhì)量和造血干細(xì)胞移植術(shù)的治療效果。我們在過去的研究中發(fā)現(xiàn)，aGVHD患者出現(xiàn)造血功能障礙與預(yù)后不佳相關(guān)，半相合移植aGVHD小鼠模型中造血干/祖細(xì)胞數(shù)量和比例減少，提示骨髓可能是aGVHD的靶器官之一。ShonoY等亦提出了骨髓aGVHD的概念，認(rèn)為a

3、GVHD時的造血功能障礙源于aGVHD對骨髓造血微環(huán)境(niche)攻擊，造成niche支持造血功能失調(diào)，從而影響造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cell，HSC)的功能。造血微環(huán)境(niche)是造血干細(xì)胞定居的場所，支持和調(diào)控造血干細(xì)胞的功能。niche包括多種細(xì)胞組分，Mendez-Ferrer S等認(rèn)為，Nestin+細(xì)胞是niche的重要細(xì)胞組分之一，屬于間充質(zhì)干細(xì)胞，為交感神經(jīng)調(diào)控信號受體(β3腎上腺素受體

4、)，高表達(dá)造血支持困子(如CXCL12，c-Kitligand，IL-7，angiopoietin-1，VCAM-1)，提示Nestin+細(xì)胞對于支持和調(diào)節(jié)HSC功能有重要的作用。為探討aGVHD所致造血功能受抑的機(jī)制，研究aGVHD時骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞在骨髓有核細(xì)胞中的比例及絕對數(shù)量的變化及變化機(jī)制，以尋找aGVHD所致造血功能障礙的原因，為進(jìn)一步尋找aGVHD治療手段、提高造血干細(xì)胞移植療效奠定理論基礎(chǔ)。
　　

5、 第一部分骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞的一般生物學(xué)特性
　　 方法：
　　 取正常6-8周齡雌性CB6F1小鼠骨髓細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓有核細(xì)胞中CD45-Nestin+細(xì)胞的比例、絕對數(shù)量、細(xì)胞表型(間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD44、CD29、Sca-1，血管內(nèi)皮標(biāo)記VEGFR3，造血干/祖細(xì)胞標(biāo)記c-Kit，主要組織相容復(fù)合物MHC-Ⅱ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
　　 結(jié)果：
　　 1、骨髓CD4

6、5-Nestin+細(xì)胞數(shù)量骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞占骨髓有核細(xì)胞(0.08±0.00)％，占CD45。細(xì)胞的(4±0.6)％，以每只小鼠骨髓有核細(xì)胞總數(shù)2.5×108計算，骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞絕對數(shù)量約為(1.6±0)×105/只，為骨髓中一類稀有細(xì)胞。
　　 2、骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞細(xì)胞表型骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記CD44(98.70±1.49)％、CD29(84

7、.88±13.57)％、Sca-1(89.9±3.50)％，不表達(dá)血管內(nèi)皮的標(biāo)記VEGFR3，不表達(dá)造血干/祖細(xì)胞標(biāo)記c-Kit，不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物MHC-Ⅱ。
　　 第二部分aGVHD時骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞數(shù)量的變化
　　 方法：
　　 以8-10周齡雄性B6.SJL小鼠為供體，6-8周齡雌性CB6F1小鼠為受體，接受133Cs射線一次照射，總劑量為8Gy，構(gòu)建半相合骨髓移植aGVHD模型、

8、半相合單純骨髓移植(Bone marrow transplantation，BMT)模型。aGVHD組每只受體小鼠移植骨髓有核細(xì)胞5×106和脾細(xì)胞6×107，BMT小鼠每只受體小鼠僅移植相同數(shù)量骨髓有核細(xì)胞5×106。移植后通過生存分析、觀察aGVHD表現(xiàn)、靶器官病理、外周血血常規(guī)、骨髓有核細(xì)胞總數(shù)、供體細(xì)胞植入率、骨髓造血干/祖細(xì)胞絕對數(shù)量驗(yàn)證aGVHD、BMT模型構(gòu)建成功。移植后+7天、+14天、+21天流式細(xì)胞術(shù)分別檢測aGVH

9、D組和BMT組小鼠骨髓有核細(xì)胞中含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞群體(以CD45-c-Kit-CD44+CD29+設(shè)門)在骨髓有核細(xì)胞中比例、絕對數(shù)量，CD45Nestin+細(xì)胞在骨髓有核細(xì)胞中比例、絕對數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計量資料比較采用SPSS16.0軟件包，進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。生存資料比較通過graphpad prism 5軟件，進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1、aGVHD組

10、小鼠存在造血功能障礙移植后+7天，aGVHD組和BMT組受鼠外周血三系均達(dá)低谷，此后逐漸恢復(fù)，aGVHD組三系恢復(fù)較BMT組快，但移植后+21天左右，aGVHD組處周血三系均出現(xiàn)明顯下降，顯著低于BMT組。移植后+7天、+14天、+21天aGVHD組全骨髓有核細(xì)胞總數(shù)、供體細(xì)胞植入率、供體來源造血干細(xì)胞(HSC)、造血祖細(xì)胞(HPC)絕對數(shù)量均低于BMT組。
　　 2、aGVHD時骨髓含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞群體在骨髓有核細(xì)胞中比

11、例未減少，但絕對數(shù)量減少移植后+7天、+14天、+21天aGVHD組骨髓含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞群體(以CD45-c-Kit-CD44+CD29+設(shè)門)在骨髓有核細(xì)胞中比例與BMT組無顯著差異，但絕對數(shù)量低于BMT組[移植后+7天：(3.63±0.66)×105vs(7.75±2.08)×105，P=0.05；移植后+14天：(4.4±0)×105vs(12.8±1.73)×105，P=0.034；移植后+21天：(1.8±1.08)×1

12、05vs(25.47±9.63)×105，P=0.05]。
　　 3、aGVHD時骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞在骨髓有核細(xì)胞中比例、絕對數(shù)量均減少移植后+7天、+14天、+21天aGVHD組骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞在骨髓有核細(xì)胞中比例低于BMT組[移植后+7天：(0.0366±0.004)％vs(0.071±0.01)％，P=0.008；移植后+14天：(0.027±0.007)％vs(0.054±0.013)％，P

13、=0.008；移植后+21天：(0.019±0.004)％vs(0.053±0.006)％，P=0.008]；絕對數(shù)量低于BMT組[移植后+7天：(1.62±0.192)×104vs(4.37±0.65)×104，P=0.009；移植后+14天：(1.24±0.34)×104vs(7.96±1.92)×104，P=0.009；移植后+21天：(0.564±0.14)×104vs(19.316±2.31)×104，P=0.008]。

14、>　　 第三部分aGVHD時骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞數(shù)量減少的機(jī)制
　　 方法：
　　 移植后+3天、+7天、+14天流式細(xì)胞術(shù)分別檢測aGVHD組和BMT組小鼠骨髓供體來源CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞FASL表達(dá)、骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞FAS表達(dá)。移植后+7天、+14天、+21天流式細(xì)胞術(shù)分別檢測aGVHD組和BMT組小鼠骨髓有核細(xì)胞中含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞群體(以CD45-c-Kit-CD44+C

15、D29+設(shè)門)趨化因子CXCR4表達(dá)；CD45-Nestin+細(xì)胞趨化因子CXCR4、粘附分子CD44表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計量資料比較采用SPSS16.0軟件包，進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1、aGVHD時骨髓供體來源CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞FASL表達(dá)均增加，骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞FAS表達(dá)增加移植后+3天、+7天、+14天aGVHD組CD4+T淋巴細(xì)胞FAS

16、L表達(dá)高于BMT組[移植后+3天：(92.2±0.8)％vs(68.63±6.55)％，p=0.003；移植后+7天：(72.2±8.61)％vs(31.35±7.84)％，p=0.007；移植后+14天：(72.8±12.48)％vs(45.32±5.06)％，p=0.002]；CD8'T淋巴細(xì)胞FASL表達(dá)高于BMT組[移植后+3天：(62.6±1.44)％vs(15.73±1.88)％，p=0.015；移植后+7天：(65.6±5

17、.77)％vs(14.7±3.2)％，p=0.008；移植后+14天：(56.3±5.44)％vs(16.2±6.31)％，p=0.0021；骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞FAS表達(dá)高于BMT組[移植后+3天：(94.2±5.6)％vs(2.56±0.82)％，p=0.001；移植后+7天：(89.42±4.41)％vs(3.45±0.84)％，p=0.002；移植后+14天：(87.3±3.48)％vs(3.32±0.46)％，p=

18、0.002]。
　　 2、aGVHD時含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞群體趨化因子CXCR4表達(dá)減少移植后+7天、+14天、+21天aGVHD組骨髓含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞群體(以CD45-c-kit-CD44+CD29+設(shè)門)CXCR4的表達(dá)低于BMT組[移植后+7天：(19.76±3.9)％vs(19.44±3.21)％，p=0.89；移植后+14天：(5.98±3.75)％vs(17.44±7.85)％，p=0.006；移植后+21天

19、：(16.25±3.63)％vs(49.93±7.12)％，p=0.003]。
　　 3、aGVHD時骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞趨化因子CXCR4、粘附分子CD44表達(dá)減少移植后+7天、+14天、+21天aGVHD組骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞趨化因子CXCR4的表達(dá)低于BMT組[移植后+7天：(38.74±9.76)％vs(51.26±10.11)％，p=0.095；移植后+14天：(17.84±4.48)％vs(5

20、4.61±8.97)％，p=0.008；移植后+21天：(27.71±1.08)％vs(67.38±2.09)％，p=0.002]；aGVHD組骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞粘附分子CD44的表達(dá)雖在移植后逐漸上升，但仍低于BMT組[移植后+7天：(35.34±6.31)％vs(53.88±7.32)％，p=0.016；移植后+14天：(41.22±13.53)％vs(84.26±7.81)％，p=0.008；移植后+21天：(71.

21、95±5.22)％vs(92.498±0.98)％，p=0.008]。
　　 結(jié)論：
　　 骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞為骨髓中的一類稀有細(xì)胞，高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記CD44、CD29、Sca-1，不表達(dá)血管內(nèi)皮的標(biāo)記VEGFR3，不表達(dá)造血干/祖細(xì)胞標(biāo)記c-Kit，不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物MHC-Ⅱ。aGVHD時含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞群體(以CD45-c-kit-CD44+CD29+設(shè)門)在骨髓有核細(xì)胞中比例未

22、減少，但絕對數(shù)量減少；aGVHD時骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞在骨髓有核細(xì)胞中比例、絕對數(shù)量均減少。aGVHD時骨髓供體來源CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞均高表達(dá)FASL，且移植早期CD4+T淋巴細(xì)胞FASL表達(dá)水平高于CD8+T淋巴細(xì)胞，同時骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞高表達(dá)FAS/aGVHD時供體T淋巴細(xì)胞可能通過FAS-FASL途徑，介導(dǎo)免疫攻擊，誘導(dǎo)骨髓CD45-Nestin+細(xì)胞凋亡，可能是aGVHD時骨髓CD45-Ne