異基因造血干細(xì)胞移植相關(guān)移植物抗宿主病發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分：協(xié)同刺激因子在異基因造血干細(xì)胞移植相關(guān)移植物抗宿主病發(fā)病機(jī)制中的作用 目的探討協(xié)同刺激因子(costimulatorymolecular，CM)、CD4+CD25+T細(xì)胞和相關(guān)臨床參數(shù)(年齡、性別、病種、預(yù)處理方案、中性粒細(xì)胞(ANC)和血小板計(jì)數(shù)(PLT)的恢復(fù)時(shí)間、輸注MNC和CD34+細(xì)胞數(shù)、血型、HLA配型、感染)在異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneicHematopoieticStemCellTransp

2、lantation，allo-HSCT)相關(guān)移植物抗宿主病(graftversushostdisease，GVHD)發(fā)生、發(fā)展中所起的作用，進(jìn)而明確上述因素對(duì)急、慢性GVHD，尤其是急性GVHD的診斷、治療以及判斷預(yù)后方面是否有價(jià)值。 方法1、將21例行allo-HSCT的血液病和實(shí)體瘤患者根據(jù)預(yù)處理方案不同分為非清髓性HSCT組(A組，即：NST組)和清髓性HSCT組(B組)；根據(jù)是否發(fā)生GVHD及發(fā)生GVHD的類型，分為5組

3、：1組(A組發(fā)生aGVHD者)，2組(A組發(fā)生cGVHD者)，3組(B組發(fā)生aGVHD者)，4組(B組未發(fā)生GVHD者)，5組(A組未發(fā)生GVHD者)； 2、對(duì)21例患者在移植前及術(shù)后不同時(shí)間(+7天、+14天、+21天、+30天、發(fā)生GVHD時(shí)及GVHD治療后)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀(flowcytometry，F(xiàn)CM)免疫熒光法行外周血CD4+T細(xì)胞表面CM(CD28、CD80、CD152)及CD25的檢測(cè)； 3、用短串聯(lián)

4、重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)STR-PCR方法檢測(cè)微衛(wèi)星嵌合體形成。 結(jié)果1.造血功能重建和植入：21例患者移植后均獲得造血功能重建，移植后中性粒細(xì)胞絕對(duì)值(ANC)≥0.5×109/L的中位時(shí)間：NST組合并aGVHD為11d(8-13d)，合并cGVHD為10d(9-12d)，無GVHD為10d(7-12d)；allo-HSCT組合并aGVHD為16d(13-21d)，無GVHD為12d(8-15d)；血小板計(jì)數(shù)(PTS)≥20×1

5、09/L的中位時(shí)間：NST組合并aGVHD為9d(5-12d)，合并cGVHD為8d(7-9d)，無GVHD為10d(5-12d)；allo-HSCT組合并aGVHD為20d(8-51d)，無GVHD為11d(9-14d)；21例患者移植后經(jīng)STR檢測(cè)均轉(zhuǎn)為混合嵌合體(MC)或完全嵌合體(CC)，其中，10例患者1個(gè)月后轉(zhuǎn)為CC，2例3個(gè)月后轉(zhuǎn)為CC，9例移植后始終為MC。 2.不同預(yù)處理方案GVHD發(fā)生率無差別(χ2=3.71

6、1，P=0.144)； 3.移植后感染的發(fā)生情況：A組和B組比較，細(xì)菌和真菌的感染率(41.7％和44％，0％和11％)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)； 4.生存情況：隨訪至2006年3月，隨訪中位時(shí)間，A組14個(gè)月(5-22個(gè)月)，B組14個(gè)月(2-52個(gè)月)，兩組隨訪時(shí)間無差異(P＞0.05)，5例死亡：2例死于原發(fā)疾病復(fù)發(fā)引起的多臟器功能衰竭，1例死于腦出血，2例死于急性GVHD引起的肝功能衰竭；其余均無疾病進(jìn)

7、展而生存； 5.根據(jù)患者發(fā)生GVHD情況，對(duì)21例患者進(jìn)行COX回歸分析：性別、年齡、預(yù)處理方案、感染、血型、HLA配型以及ANC和PLT恢復(fù)時(shí)間均與GVHD的發(fā)生與否無關(guān)(P＞0.05)；上述臨床參數(shù)均不影響生存期；CD4CD25、CD4CD152表達(dá)能明顯影響GVHD發(fā)生(χ2=13.128，P＜0.0001)； 6.術(shù)后隨著時(shí)間推移，直至發(fā)生GVHD，患者外周血T細(xì)胞表面CD4+CD25+、CD4+CD28+、CD

8、4+CD80+的變化趨勢(shì)一致，均是逐漸增高，在發(fā)生GVHD時(shí)達(dá)到高峰，經(jīng)過治療和控制GVHD后，各指標(biāo)的表達(dá)又逐漸下降，甚至恢復(fù)到正常水平；經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，3指標(biāo)在A組和B組的表達(dá)不同，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，B組明顯高于A組；1、2、3組(發(fā)生GVHD組)與4、5組(無GVHD組)相比，明顯高于后兩者(P＜0.001)；在1、2、3組間比較，有明顯差異(P＜0.001)，3組的表達(dá)明顯高于1、2組； 7.T細(xì)胞表面CD

9、4+CD152+的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，在GVHD時(shí)最低，經(jīng)過治療和控制GVHD后，各指標(biāo)的表達(dá)又逐漸上升，甚至恢復(fù)到正常水平；經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，CD4+CD152+在A組和B組的表達(dá)不同，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，B組明顯低于A組；1、2、3組(發(fā)生GVHD組)與4、5組(無GVHD組)相比，明顯低于后兩者(P＜0.001)；在1、2、3組間比較，有明顯差異(P＜0.001)，3組的表達(dá)明顯低于1、2組。 結(jié)論1.清髓

10、性HSCT和NST的GVHD發(fā)生率無差別； 2.相關(guān)臨床參數(shù)(年齡、性別、病種、預(yù)處理方案、ANC和PLT的恢復(fù)時(shí)間、輸注MNC和CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)、血型、HLA配型、感染)對(duì)GVHD的發(fā)生沒有影響；上述臨床參數(shù)及GVHD的發(fā)生與否均不影響生存期；T細(xì)胞表面CD4CD25、CD4CD152的表達(dá)獨(dú)立于其它相關(guān)參數(shù)，更能影響GVHD的發(fā)生。 3.CM的表達(dá)情況與GVHD相關(guān)：T細(xì)胞表面CD4+CD25+、CD4+CD28+

11、、CD4+CD80+、CD4+CD152+的表達(dá)水平與GVHD的發(fā)生有關(guān)，而且在清髓性HSCT和NST的表達(dá)不同。降低CD4+CD25+、CD4+CD28+、CD4+CD80+水平，提高CD4+CD152+水平有望減低移植后GVHD的發(fā)生率。 4.B7-CD28/CD152共刺激途徑在GVHD的發(fā)生中起重要作用，檢測(cè)allo-HSCT患者移植后外周血T細(xì)胞共刺激通路相關(guān)分子的表達(dá)情況，有助于GVHD的早期診斷。 第二部分

12、：細(xì)胞因子在異基因造血干細(xì)胞移植相關(guān)移植物抗宿主病發(fā)病機(jī)制中的作用 目的探討allo-HSCT發(fā)生GVHD時(shí)外周血相關(guān)細(xì)胞因子(cytokine，CK)的表達(dá)水平及其與GVHD的關(guān)系，以期找到檢測(cè)CK的敏感、可行的方法以及可以早期預(yù)測(cè)GVHD發(fā)生、特異性高、有臨床應(yīng)用價(jià)值的指標(biāo)。 方法對(duì)21例行allo-HSCT的患者移植前和移植后不同時(shí)間(+7天、+14天、+21天、+30天、發(fā)生GVHD時(shí)、GVHD治療后)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患

13、者外周血CK(白細(xì)胞介素2(IL-2)、可溶性白細(xì)胞介素2受體(sIL-2R)、γ-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1))的表達(dá)和變化情況： 1、采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)在基因水平檢測(cè)患者不同時(shí)間外周血CK的表達(dá)情況； 2、用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)在蛋白水平檢測(cè)患者不同時(shí)間外周血CK的表達(dá)情況。 結(jié)果1、無論是RT-PCR方法檢測(cè)外周

14、血CK目的基因的相對(duì)表達(dá)量還是ELISA法檢測(cè)血清CK的蛋白含量，均符合如下變化趨勢(shì)： (1)在術(shù)后隨著時(shí)間推移，直至發(fā)生GVHD，患者IL-2、IL-2R、IFN-γ的變化趨勢(shì)一致，均是逐漸增高，IL-2、IL-2R在+14天時(shí)已經(jīng)明顯高于術(shù)前(IL-2R甚至是在+7天，P＜0.05)，在GVHD時(shí)達(dá)高峰，經(jīng)過治療和控制GVHD后，各指標(biāo)的表達(dá)又逐漸下降，甚至恢復(fù)到正常水平；經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，3指標(biāo)在A組和B組的表達(dá)不同，有統(tǒng)

15、計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，B組明顯高于A組；1、2、3組(發(fā)生GVHD組)與4、5組(無GVHD組)相比，明顯高于后兩者(P＜0.001)；在1、2、3組間比較，有明顯差異(P＜0.001)，3組的表達(dá)明顯高于1、2組； (2)TGF-β1的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，在GVHD時(shí)最低，經(jīng)過治療和控制GVHD后，各指標(biāo)的表達(dá)又逐漸上升，甚至恢復(fù)到正常水平；經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，TGF-β1在A組和B組的表達(dá)不同，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.

16、01)，B組明顯低于A組；1、2、3組(發(fā)生GVHD組)與4、5組(無GVHD組)相比，明顯低于后兩者(P＜0.001)；在1、2、3組間比較，有明顯差異(P＜0.001)，3組的表達(dá)明顯低于1、2組； (3)經(jīng)卡方檢驗(yàn)確切概率法得出：IL-2mRNA、sIL-2RmRNA、IFN-γmRNA、TGF-β1mRNA表達(dá)陽(yáng)性率與GVHD發(fā)生相關(guān)(因IL-4在標(biāo)本的檢測(cè)中陽(yáng)性率很低，故未能進(jìn)行比較)(P均＜0.001)； (

17、4)IL-4在各個(gè)分組中表達(dá)水平的變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而且，在很多標(biāo)本檢測(cè)的含量都很低； 2.sIL-2R、IL-2、IFN-γ、TGF-β1表達(dá)與感染發(fā)生無顯著相關(guān)(P＞0.05)；3.COX回歸分析顯示：相關(guān)臨床參數(shù)(年齡、性別、病種、ANC和PLT恢復(fù)時(shí)間、輸注MNC和CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)、血型、HLA配型、感染)對(duì)CK的表達(dá)和GVHD發(fā)生沒有影響(P＞0.05)；IL-2、sIL-2R、TGF-β1的表達(dá)能