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文檔簡介
1、目的:造血干細(xì)胞是所有成熟血細(xì)胞的來源。異基因造血干細(xì)胞移植現(xiàn)已成為治療良、惡性血液系統(tǒng)疾病、一些實體瘤、某些自身免疫性疾病的重要手段。但移植過程中及移植后的并發(fā)癥仍是導(dǎo)致影響患者生活質(zhì)量、導(dǎo)致患者死亡的重要因素,其中最突出的并發(fā)癥為急性移植物抗宿主病(acute gaft-versus-host disease,aGVHD)。aGVHD是供體T淋巴細(xì)胞與受體組織之間的免疫反應(yīng),其病理生理機(jī)制為植入的供體免疫活性細(xì)胞被宿主抗原致敏而激活
2、、增殖分化從而導(dǎo)致宿主靶器官損害[1]。臨床實踐中我們發(fā)現(xiàn),重度急性GVHD的患者(Ⅲ-Ⅳ度),多出現(xiàn)一系、兩系甚至全血細(xì)胞減少,對刺激造血因子治療反應(yīng)欠佳,且無法從根本上解決問題。研究證實急性GVHD是造血功能低下的主要危險因素,而GVHD患者出現(xiàn)血小板減少是預(yù)后差的因素之一。目前少有研究涉及造血干細(xì)胞移植后GVHD患者體內(nèi)供體來源正常造血干細(xì)胞數(shù)量和功能變化。因此,本課題以半相合造血干細(xì)胞移植后急性GVHD為模型,研究急性GVHD環(huán)
3、境中供體來源正常造血細(xì)胞數(shù)量和功能變化。 研究方法:小鼠造血干細(xì)胞移植供體小鼠:C57BL/6(H-2b)。受體小鼠:CB6F1(BALB/c×C57BL/6:F1)(H-2b/d)。小鼠半相合移植模型受體小鼠移植前接受8Gy一次照射,隨機(jī)分為三組。空白對照組僅接受輸注PBS。GVHD組每只受體小鼠移植C57BL/6來源的骨髓細(xì)胞5×106、脾臟細(xì)胞6×107。正常移植對照組每只小鼠僅移植C57BL/6來源的骨髓細(xì)胞5×106。
4、HSC/HPC數(shù)量以Lin-c-Kit+ Sca-1+(LKS)為造血干細(xì)胞(HSC)的表型,Lin-c-Kit+Sca-1-(LKS-)為造血祖細(xì)胞(HPC)的表型。移植后不同時間點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)分別檢測正常對照和GVHD小鼠體內(nèi)HSC和HPC的數(shù)量。集落形成單位(CFU)檢測移植后2周取GVHD組和正常移植對照組全骨髓細(xì)胞進(jìn)行CFU檢測,14天后顯微鏡下計數(shù)集落數(shù),每組8個復(fù)孔。鵝卵石樣細(xì)胞形成(CAFC)實驗移植后2周,GVHD組和正
5、常移植對照組全骨髓細(xì)胞,用MyeloCultTM M5300培養(yǎng)基重懸。分為1×105,5×104,2.5×104,1.25×104,6.25×103,3×1036個劑量組,以原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,并按設(shè)計濃度加入測試細(xì)胞,33℃,5%CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)5周。取d35 CAFC數(shù)據(jù)計算不同造血環(huán)境中CD45.1+細(xì)胞的CAFC頻率。細(xì)胞凋亡分析移植后2周,用Annexin V-PE試劑盒結(jié)合HSC/HPC細(xì)胞標(biāo)記(Lin-),流
6、式細(xì)胞術(shù)檢測兩組HSC/HPC的凋亡水平。HSC/HPC歸巢相關(guān)因子CD44表達(dá)水平移植后不同時間點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)檢測HSC/HPC中CD44表達(dá)率。HSC/HPC細(xì)胞周期采用BrdU試劑盒,結(jié)合HSC/HPC標(biāo)記,檢測GVHD小鼠HSC/HPC的細(xì)胞周期狀態(tài)。T細(xì)胞植入檢測分別檢測供體脾細(xì)胞及移植后5天、7天、11天、14天受體骨髓細(xì)胞中CD3、CD4、CD8比例。統(tǒng)計學(xué)分析計量資料比較采用Student t test,計數(shù)資料比較采用χ
7、test。最大似然法采用統(tǒng)計軟件L-Calc分析,生存資料采用Prism4.0軟件分析。 結(jié)果:成功建立小鼠半相合移植急性移植物抗宿主病模型急性GVHD組小鼠移植10天后逐漸出現(xiàn)腹瀉、血便、體重減輕、脫毛、弓背等表現(xiàn),中位生存時間14天(4~18天);對照組除死于放射后并發(fā)癥外(n=1),其余均存活。急性GVHD的發(fā)病率為100%。急性GVHD環(huán)境中HSC/HPC數(shù)量顯著低于正常移植對照組移植后2周,LKS(Lin-c.Kit+
8、Sca-1+)比例分別為12.42×10-4和82.55×10-4(P=0.02);LKS-(Lin-c-Kit+Sca-1-)分別為6.46%和1.66%(P=0.015),Lin-分別為12.46%和3.66%(P=0.0011)。急性GVHD環(huán)境中供體來源正常造血細(xì)胞CFU形成能力顯著下降移植后2周,相比正常移植對照組,急性GVHD組造血細(xì)胞集落形成能力均有不同程度下降,CFU-G[(7.54±1.60)vs(3.5±1.19),
9、P<0.001],CFU-M[(5.9±1.36)vs(3.6±1.41),P=0.006]、CFU-GM[(2.6±0.74)vs(2.2±0.64),P=0.172]、CFU-Mix[(1.5±0.53)vs(0.5±0.53),P=0.002],對照組CFU總數(shù)約為aGVHD組的2倍[(17.5±2.07)vs(9.75±2.12),P=0.0000034]。以上數(shù)據(jù)說明在急性GVHD環(huán)境中,集落形成單位(反映HPC頻率)明顯下降
10、或單位祖細(xì)胞克隆形成能力下降。急性GVHD環(huán)境中造血細(xì)胞CAFC頻率下降移植后2周,極限稀釋法連續(xù)體外培養(yǎng)CAFC5周后,計數(shù)。急性GVHD組CAFC頻率為1/991,147,對照組為1/335,229。對照組造血細(xì)胞的CAFC頻率約為急性GVHD組的3倍(P<0.05)。CAFC是HSC頻率的體外替代實驗,此數(shù)據(jù)說明aGVHD環(huán)境中HSC頻率明顯下降。急性GVHD環(huán)境下HSC/HPC凋亡比例增加不明顯相比于對照組,移植后2周急性GVH
11、D環(huán)境中正常Lin-細(xì)胞群凋亡比例僅略升高,分別為(13.8±1.21)%和(8.73±1.39)%(P=0.48)。結(jié)果說明,急性GVHD并不直接增加HSC/HPC凋亡比例,GVHD宿主各類早期細(xì)胞的減少,并不由于其生存時間縮短引起。急性GVHD組HSC歸巢相關(guān)分子CD44表達(dá)增高移植后不同時間點(diǎn)GVHD組受鼠LSK細(xì)胞CD44表達(dá)均較對照組高(P<0.03)。急性GVHD組移植后早期HSC/HPC進(jìn)入S比例顯著升高發(fā)生急性GVHD的
12、宿主HPC(Lin-Sca-1+)在16小時內(nèi)進(jìn)入S期的比例顯著增高(3.58%vs1.51%,P<.001),而這一增殖過程在移植后72小時停止,而以其下游的Lin-細(xì)胞為主(18.72%vs9.24%,P<.001)。 結(jié)論:1.首次證明在急性GVHD環(huán)境中,正常HSC/HPC數(shù)量顯著低于正常移植對照組,且體外CFU和CAFC等克隆形成能力顯著下降。結(jié)果提示,急性GVHD的發(fā)生能直接抑制正常HSC/HPC增殖,但并不縮短正常
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